pcr反應(yīng)(PCR操作時(shí)注意事項(xiàng))
1.PCR操作時(shí)注意事項(xiàng)
1. PCR引物設(shè)計(jì)：
引物設(shè)計(jì)可能是PCR擴(kuò)增成功最關(guān)鍵的因素。如引物設(shè)計(jì)欠佳，可能導(dǎo)致擴(kuò)增產(chǎn)物不足，甚至擴(kuò)增失敗，其原因是設(shè)計(jì)欠佳的引物可導(dǎo)致非特異擴(kuò)增和/或形成引物二聚體，此又成為PCR反應(yīng)的競(jìng)爭(zhēng)性產(chǎn)物，從而進(jìn)一步抑制PCR產(chǎn)物形成。
在引物設(shè)計(jì)時(shí)必須考慮以下幾個(gè)因素，其中最重要的是引物長(zhǎng)度、溶解溫度（Tm）、特異性、引物序列互補(bǔ)問(wèn)題、G/C 含量和多嘧啶（T,C） 或多嘌呤（A, G）延伸、3'-末端序列等。
(1)引物長(zhǎng)度：由于PCR反應(yīng)的特異性、退火溫度以及時(shí)間均至少部分與PCR引物長(zhǎng)度相關(guān)聯(lián)，因此引物長(zhǎng)度是PCR擴(kuò)增是否成功關(guān)鍵的因素。一般PCR引物長(zhǎng)度為15-30核苷酸。
(2)溶解溫度（Tm）：因加熱而斷開(kāi)H鍵，使雙鏈DNA分開(kāi)或“溶解”為單鏈DNA。溶解溫度（Tm）即指使一半雙鏈DNA變?yōu)閱捂淒NA的溫度。Tm可采用下列公式計(jì)算：Tm=2(A+T) + 4(G+C)。
需注意PCR反應(yīng)至少有兩個(gè)（一對(duì)）引物，兩個(gè)寡核苷酸引物Tm 值應(yīng)比較接近，不可差異過(guò)大。因有較高的Tm值的引物在較低的反應(yīng)溫度時(shí)可發(fā)生錯(cuò)配，而引物Tm值較低，反應(yīng)溫度較高時(shí)則可能不能發(fā)生作用，因此如引物的Tm值差異較大，可導(dǎo)致PCR擴(kuò)增效率低下甚至擴(kuò)增失敗。
(3)引物序列互補(bǔ)：設(shè)計(jì)引物時(shí)應(yīng)絕對(duì)沒(méi)有3個(gè)堿基以上的內(nèi)引物配對(duì)，如引物有這樣具有自我配對(duì)的區(qū)域，“彈回”即部分雙鏈結(jié)構(gòu)將發(fā)生在退火反應(yīng)時(shí)。
(4)G/C 含量和多嘧啶（T,C） 或多嘌呤（A, G）延伸：待選擇的引物序列應(yīng)盡可能是堿基隨意分布，G+C含量平均-避免長(zhǎng)A+T和富含G+C的區(qū)域。在引物的堿基組成中GC含量一般為45%-55%。在選擇的引物序列中應(yīng)沒(méi)有多G 或多C延伸，因其可促進(jìn)非特異性退火，多A 和多T延伸也應(yīng)避免，因其可“呼吸”和使引物-模板復(fù)合物展開(kāi)延伸，降低擴(kuò)增的效率。同時(shí)多嘧啶（T,C）和多嘌呤（A,G）延伸也應(yīng)被避免。
(5)3'-末端序列：為控制引物錯(cuò)配，應(yīng)認(rèn)真地確定PCR引物中3'末端的位置。
總而言之，應(yīng)重視PCR引物設(shè)計(jì)，設(shè)計(jì)PCR引物時(shí)應(yīng)認(rèn)真小心。對(duì)于一個(gè)成功的PCR來(lái)說(shuō)，幾個(gè)重要因素如引物長(zhǎng)度、GC含量和3'序列必須優(yōu)化。理想的引物應(yīng)為差不多隨意分布的核苷酸混合、GC含量50%、長(zhǎng)度約為20個(gè)堿基，因此能使Tm值處于56-62oC范圍。分析靶基因潛在引物位點(diǎn)時(shí)，應(yīng)考慮無(wú)單聚合體， 沒(méi)有明顯的二級(jí)結(jié)構(gòu)形成的傾向，不自我互補(bǔ)，與其他雙鏈靶基因序列沒(méi)有明顯的同源性。為避免枯燥無(wú)味的設(shè)計(jì)，節(jié)省時(shí)間，減少錯(cuò)誤，可應(yīng)用計(jì)算機(jī)程序優(yōu)化設(shè)計(jì)、選擇、確定寡核苷酸引物。
2.PCR的操作注意事項(xiàng)
實(shí)驗(yàn)操作注意事項(xiàng)：盡管擴(kuò)增序列的殘留污染大部分是假陽(yáng)性反應(yīng)的原因，樣品間的交叉污染也是原因之一。因此，不僅要在進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)是謹(jǐn)慎認(rèn)真，在樣品的收集、抽提和擴(kuò)增的所有環(huán)節(jié)都應(yīng)該注意：
(1)戴一次性手套，若不小心濺上反應(yīng)液，立即更換手套。
(2)使用一次性吸頭，嚴(yán)禁與PCR產(chǎn)物分析室的吸頭混用，吸頭不要長(zhǎng)時(shí)間暴露于空氣中，避免氣溶膠的污染。
(3)避免反應(yīng)液飛濺，打開(kāi)反應(yīng)管時(shí)為避免此種情況，開(kāi)蓋前稍離心收集液體于管底。若不小心濺到手套或桌面上，應(yīng)立刻更換手套并用稀酸擦拭桌面。
(4)操作多份樣品時(shí)，制備反應(yīng)混合液，先將dNTP、緩沖液、引物和酶混合好，然后分裝，這樣即可以減少操作，避免污染，又可以增加反應(yīng)的精確度。
(5)最后加入反應(yīng)模板，加入后蓋緊反應(yīng)管。
(6)操作時(shí)設(shè)立陰陽(yáng)性對(duì)照和空白對(duì)照，即可驗(yàn)證PCR反應(yīng)的可靠性，又可以協(xié)助判斷擴(kuò)增系統(tǒng)的可信性。
(7)盡可能用可替換或可高壓處理的加樣器，由于加樣器最容易受產(chǎn)物氣溶膠或標(biāo)本DNA的污染，最好使用可替換或高壓處理的加樣器。如沒(méi)有這種特殊的加樣器，至少PCR操作過(guò)程中加樣器應(yīng)該專(zhuān)用，不能交叉使用，尤其是PCR產(chǎn)物分析所用加樣器不能拿到其它兩個(gè)區(qū)。
(8)重復(fù)實(shí)驗(yàn)，驗(yàn)證結(jié)果，慎下結(jié)論。
3.簡(jiǎn)述建立pcr反應(yīng)體系時(shí)需注意哪些問(wèn)題
標(biāo)準(zhǔn)的PCR反應(yīng)體系：10*擴(kuò)增緩沖液 10ul
4種dNTP混合物 各200umol/L
引物 各10~100pmol
模板DNA 0.2ug
Taq DNA聚合酶 2.5u
Mg2+ 1.5mmol/L
加雙或三蒸水至 100ul PCR反應(yīng)五要素：參加PCR反應(yīng)的物質(zhì)主要有五種即引物、酶、dNTP、模板和Mg2+ 引物：引物是PCR特異性反應(yīng)的關(guān)鍵，PCR 產(chǎn)物的特異性取決于引物與模板DNA互補(bǔ)的程度.理論上，只要知道任何一段模板DNA序列，就能按其設(shè)計(jì)互補(bǔ)的寡核苷酸鏈做引物，利用PCR就可將模板DNA在體外大量擴(kuò)增.設(shè)計(jì)引物應(yīng)遵循以下原則：①引物長(zhǎng)度：15-30bp，常用為20bp左右.②引物擴(kuò)增跨度：以200-500bp為宜，特定條件下可擴(kuò)增長(zhǎng)至10kb的片段.③引物堿基：G+C含量以40-60%為宜，G+C太少擴(kuò)增效果不佳，G+C過(guò)多易出現(xiàn)非特異條帶.ATGC最好隨機(jī)分布，避免5個(gè)以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列.④避免引物內(nèi)部出現(xiàn)二級(jí)結(jié)構(gòu)，避免兩條引物間互補(bǔ)，特別是3'端的互補(bǔ)，否則會(huì)形成引物二聚體，產(chǎn)生非特異的擴(kuò)增條帶.⑤引物3'端的堿基，特別是最末及倒數(shù)第二個(gè)堿基，應(yīng)嚴(yán)格要求配對(duì)，以避免因末端堿基不配對(duì)而導(dǎo)致PCR失敗.⑥引物中有或能加上合適的酶切位點(diǎn)，被擴(kuò)增的靶序列最好有適宜的酶切位點(diǎn)，這對(duì)酶切分析或分子克隆很有好處.⑦引物的特異性：引物應(yīng)與核酸序列數(shù)據(jù)庫(kù)的其它序列無(wú)明顯同源性
希望有所幫助
4.在PCR擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)中應(yīng)注意什么?
PCR產(chǎn)物的電泳檢測(cè)時(shí)間 一般為48h以?xún)?nèi)，有些最好于當(dāng)日電泳檢測(cè)，大于48h后帶型不規(guī)則甚致消失。
假陰性，不出現(xiàn)擴(kuò)增條帶 PCR反應(yīng)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)有①模板核酸的制備，②引物的質(zhì)量與特異性，③酶的質(zhì)量及， ④PCR循環(huán)條件。尋找原因亦應(yīng)針對(duì)上述環(huán)節(jié)進(jìn)行分析研究。
模板：①模板中含有雜蛋白質(zhì)，②模板中含有Taq酶抑制劑，③模板中蛋白質(zhì)沒(méi)有消 化除凈，特別是染色體中的組蛋白，④在提取制備模板時(shí)丟失過(guò)多，或吸入酚。⑤模 板核酸變性不徹底。
在酶和引物質(zhì)量好時(shí)，不出現(xiàn)擴(kuò)增帶，極有可能是標(biāo)本的消化處 理，模板核酸提取過(guò)程出了毛病，因而要配制有效而穩(wěn)定的消化處理液，其程序亦應(yīng) 固定不宜隨意更改。 酶失活：需更換新酶，或新舊兩種酶同時(shí)使用，以分析是否因酶的活性喪失或不夠而 導(dǎo)致假陰性。
需注意的是有時(shí)忘加Taq酶或溴乙錠。 引物：引物質(zhì)量、引物的濃度、兩條引物的濃度是否對(duì)稱(chēng)，是PCR失敗或擴(kuò)增條帶不 理想、容易彌散的常見(jiàn)原因。
有些批號(hào)的引物合成質(zhì)量有問(wèn)題，兩條引物一條濃度 高，一條濃度低，造成低效率的不對(duì)稱(chēng)擴(kuò)增，對(duì)策為：①選定一個(gè)好的引物合成單 位。②引物的濃度不僅要看OD值，更要注重引物原液做瓊脂糖凝膠電泳，一定要有引物條帶出現(xiàn)，而且兩引物帶的亮度應(yīng)大體一致，如一條引物有條帶，一條引物無(wú)條帶，此時(shí)做PCR有可能失敗，應(yīng)和引物合成單位協(xié)商解決。
如一條引物亮度高，一條亮度低，在稀釋引物時(shí)要平衡其濃度。③引物應(yīng)高濃度小量分裝保存，防止多次凍融或長(zhǎng)期放冰箱冷藏部分，導(dǎo)致引物變質(zhì)降解失效。
④引物設(shè)計(jì)不合理，如引物長(zhǎng)度不夠，引物之間形成二聚體等。 Mg2+濃度：Mg2+離子濃度對(duì)PCR擴(kuò)增效率影響很大，濃度過(guò)高可降低PCR擴(kuò)增的特 異性，濃度過(guò)低則影響PCR擴(kuò)增產(chǎn)量甚至使PCR擴(kuò)增失敗而不出擴(kuò)增條帶。
反應(yīng)體積的改變：通常進(jìn)行PCR擴(kuò)增采用的體積為20ul、30ul、50ul?；?00ul，應(yīng)用多 大體積進(jìn)行PCR擴(kuò)增，是根據(jù)科研和臨床檢測(cè)不同目的而設(shè)定，在做小體積如20ul 后，再做大體積時(shí)，一定要模索條件，否則容易失敗。
物理原因：變性對(duì)PCR擴(kuò)增來(lái)說(shuō)相當(dāng)重要，如變性溫度低，變性時(shí)間短，極有可能出現(xiàn)假陰性；退火溫度過(guò)低，可致非特異性擴(kuò)增而降低特異性擴(kuò)增效率退火溫度過(guò)高影響引物與模板的結(jié)合而降低PCR擴(kuò)增效率。有時(shí)還有必要用標(biāo)準(zhǔn)的溫度計(jì)，檢測(cè)一下擴(kuò)增儀或水溶鍋內(nèi)的變性、退火和延伸溫度，這也是PCR失敗的原因之一。
靶序列變異：如靶序列發(fā)生突變或缺失，影響引物與模板特異性結(jié)合，或因靶序列某 段缺失使引物與模板失去互補(bǔ)序列，其PCR擴(kuò)增是不會(huì)成功的。 假陽(yáng)性 出現(xiàn)的PCR擴(kuò)增條帶與目的靶序列條帶一致，有時(shí)其條帶更整齊，亮度更高。
引物設(shè)計(jì)不合適：選擇的擴(kuò)增序列與非目的擴(kuò)增序列有同源性，因而在進(jìn)行PCR擴(kuò)增時(shí)，擴(kuò)增出的PCR產(chǎn)物為非目的性的序列。靶序列太短或引物太短，容易出現(xiàn)假陽(yáng)性。
需重新設(shè)計(jì)引物。 靶序列或擴(kuò)增產(chǎn)物的交叉污染：這種污染有兩種原因：一是整個(gè)基因組或大片段的交叉污染，導(dǎo)致假陽(yáng)性。
這種假陽(yáng)性可用以下方法解決：操作時(shí)應(yīng)小心輕柔，防止將靶序列吸入加樣槍內(nèi)或?yàn)R出離心管外。除酶及不能耐高溫的物質(zhì)外，所有試劑或器材均應(yīng)高壓消毒。
所用離心管及樣進(jìn)槍頭等均應(yīng)一次性使用。必要時(shí)，在加標(biāo)本前，反應(yīng)管和試劑用紫外線照射，以破壞存在的核酸。
二是空氣中的小片段核酸污染，這些小片段比靶序列短，但有一定的同源性?？苫ハ嗥唇?，與引物互補(bǔ)后，可擴(kuò)增出PCR產(chǎn)物，而導(dǎo)致假陽(yáng)性的產(chǎn)生，可用巢式PCR方法來(lái)減輕或消除。
出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增帶 PCR擴(kuò)增后出現(xiàn)的條帶與預(yù)計(jì)的大小不一致，或大或小，或者同時(shí)出現(xiàn)特異性擴(kuò)增帶 與非特異性擴(kuò)增帶。非特異性條帶的出現(xiàn)，其原因：一是引物與靶序列不完全互補(bǔ)、或引物聚合形成二聚體。
二是Mg2+離子濃度過(guò)高、退火溫度過(guò)低，及PCR循環(huán)次數(shù) 過(guò)多有關(guān)。其次是酶的質(zhì)和量，往往一些來(lái)源的酶易出現(xiàn)非特異條帶而另一來(lái)源的酶 則不出現(xiàn)，酶量過(guò)多有時(shí)也會(huì)出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增。
其對(duì)策有：必要時(shí)重新設(shè)計(jì)引 物。減低酶量或調(diào)換另一來(lái)源的酶。
降低引物量，適當(dāng)增加模板量，減少循環(huán)次 數(shù)。適當(dāng)提高退火溫度或采用二溫度點(diǎn)法（93℃變性，65℃左右退火與延伸）。
出現(xiàn)片狀拖帶或涂抹帶 PCR擴(kuò)增有時(shí)出現(xiàn)涂抹帶或片狀帶或地毯樣帶。其原因往往由于酶量過(guò)多或酶的質(zhì)量 差，dNTP濃度過(guò)高，Mg2+濃度過(guò)高，退火溫度過(guò)低，循環(huán)次數(shù)過(guò)多引起。
其對(duì)策有：減少酶量，或調(diào)換另一來(lái)源的酶。②減少dNTP的濃度。
適當(dāng)降低Mg2+濃 度。增加模板量，減少循環(huán)次數(shù)。
5.PCR實(shí)驗(yàn)過(guò)程中的注意事項(xiàng)
PCR產(chǎn)物的電泳檢測(cè)時(shí)間 一般為48h以?xún)?nèi)，有些最好于當(dāng)日電泳檢測(cè)，大于48h后帶型不規(guī)則甚至消失。
PCR反應(yīng)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)有①模板核酸的制備，②引物的質(zhì)量與特異性，③酶的質(zhì)量及， ④PCR循環(huán)條件。尋找原因亦應(yīng)針對(duì)上述環(huán)節(jié)進(jìn)行分析研究。
酶切分析： 根據(jù)PCR產(chǎn)物中限制性?xún)?nèi)切酶的位點(diǎn)，用相應(yīng)的酶切、電泳分離后，獲得符合理論的片段，此法既能進(jìn)行產(chǎn)物的鑒定，又能對(duì)靶基因分型，還能進(jìn)行變異性研究。 分子雜交：分子雜交是檢測(cè)PCR產(chǎn)物特異性的有力證據(jù)，也是檢測(cè)PCR 產(chǎn)物堿基突變的有效方法。
Southern印跡雜交： 在兩引物之間另合成一條寡核苷酸鏈（內(nèi)部寡核苷酸）標(biāo)記后做探針，與PCR產(chǎn)物雜交。此法既可作特異性鑒定，又可以提高檢測(cè)PCR產(chǎn)物的靈敏度，還可知其分子量及條帶形狀，主要用于科研。
斑點(diǎn)雜交： 將PCR產(chǎn)物點(diǎn)在硝酸纖維素膜或尼膜薄膜上，再用內(nèi)部寡核苷酸探針雜交，觀察有無(wú)著色斑點(diǎn)，主要用于PCR產(chǎn)物特異性鑒定及變異分析。 氯仿抽提掉蛋白質(zhì)和其它細(xì)胞組份，用乙醇或異丙醇沉淀 核酸。
提取的核酸即可作為模板用于PCR反應(yīng)。一般臨床檢測(cè)標(biāo)本，可采用快速簡(jiǎn)便的方法溶解細(xì)胞，裂解病原體，消化除去染色體的蛋白質(zhì)使靶基因游離，直接用于PCR擴(kuò)增。
RNA模板提取一般采用異硫氰酸胍或蛋白酶K法，要防止RNase降解RNA。 溫度與時(shí)間的設(shè)置： 基于PCR原理三步驟而設(shè)置變性-退火-延伸三個(gè)溫度點(diǎn)。
在標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)中采用三溫度點(diǎn)法，雙鏈DNA在90~95℃變性，再迅速冷卻至40 ~60℃，引物退火并結(jié)合到靶序列上，然后快速升溫至70~75℃，在Taq DNA 聚合酶的作用下，使引物鏈沿模板延伸。對(duì)于較短靶基因（長(zhǎng)度為100~300bp時(shí)）可采用二溫度點(diǎn)法， 除變性溫度外、退火與延伸溫度可合二為一，一般采用94℃變性，65℃左右退火與延伸（此溫度Taq DNA酶仍有較高的催化活性）。
實(shí)驗(yàn)操作注意事項(xiàng) 盡管擴(kuò)增序列的殘留污染大部分是假陽(yáng)性反應(yīng)的原因，樣品間的交叉污染也是原因之一。因此，不僅要在進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)是謹(jǐn)慎認(rèn)真，在樣品的收集、抽提和擴(kuò)增的所有環(huán)節(jié)都應(yīng)該注意： 1. 戴一次性手套，若不小心濺上反應(yīng)液，立即更換手套； 2. 使用一次性吸頭，嚴(yán)禁與PCR產(chǎn)物分析室的吸頭混用，吸頭不要長(zhǎng)時(shí)間暴露于空氣中，避免氣溶膠的污染； 3. 避免反應(yīng)液飛濺，打開(kāi)反應(yīng)管時(shí)為避免此種情況，開(kāi)蓋前稍離心收集液體于管底。
若不小心濺到手套或桌面上，應(yīng)立刻更換手套并用稀酸擦拭桌面； 4. 操作多份樣品時(shí)，制備反應(yīng)混合液，先將dNTP、緩沖液、引物和酶混合好，然后分裝，這樣即可以減少操作，避免污染，又可以增加反應(yīng)的精確度； 5. 最后加入反應(yīng)模板，加入后蓋緊反應(yīng)管； 6. 操作時(shí)設(shè)立陰陽(yáng)性對(duì)照和空白對(duì)照，即可驗(yàn)證PCR反應(yīng)的可靠性，又可以協(xié)助判斷擴(kuò)增系統(tǒng)的可信性； 7. 盡可能用可替換或可高壓處理的加樣器，由于加樣器最容易受產(chǎn)物氣溶膠或標(biāo)本DNA的污染，最好使用可替換或高壓處理的加樣器。如沒(méi)有這種特殊的加樣器，至少PCR操作過(guò)程中加樣器應(yīng)該專(zhuān)用，不能交叉使用，尤其是PCR產(chǎn)物分析所用加樣器不能拿到其它兩個(gè)區(qū)； 8. 重復(fù)實(shí)驗(yàn)，驗(yàn)證結(jié)果，慎下結(jié)論。
6.PCR擴(kuò)增需要注意的點(diǎn)
1. 引物的質(zhì)量是保證PCR特異性的關(guān)鍵，引物過(guò)長(zhǎng)或過(guò)短均會(huì)使特異性降低，以18~30bp為宜；引物中C+G含量宜在50%左右；引物內(nèi)部和引物之間不應(yīng)含有互補(bǔ)序列；引物的堿基順序與非擴(kuò)增區(qū)域的同源性應(yīng)小于70%；引物的3'末端與模板DNA一定要配對(duì)，但末端沒(méi)有嚴(yán)格的限制，故引物設(shè)計(jì)時(shí)可在5'末端加上限制性?xún)?nèi)切酶位點(diǎn)和/或啟動(dòng)密碼ATG等；引物合成后必須純化以去除合成產(chǎn)物中的不完整序列、脫嘌呤產(chǎn)物、堿基修飾鏈等“雜質(zhì)”；引物的終濃度一般為0.2~0.5μmol/L，過(guò)低會(huì)影響反應(yīng)產(chǎn)量，過(guò)高會(huì)增加引物二聚或錯(cuò)配的幾率。
2. Taq DNA聚合酶具有5'→3'聚合酶活性和5'→3'外切酶活性，但無(wú)3'-5'外切酶活性，因此對(duì)單核苷酸的錯(cuò)配無(wú)校正功能，發(fā)生堿基錯(cuò)配的幾率為 2.1*10-4左右。然而Taq DNA聚合酶的優(yōu)勢(shì)在于反應(yīng)產(chǎn)量高于其他DNA聚合酶。Stratagene推出的Pfu DNA聚合酶一直是研究人員心目中最好的高保真酶，而Pfu DNA聚合酶經(jīng)基因工程改造后，新創(chuàng)出的Pfu Ultra具有更佳的校驗(yàn)活力。數(shù)據(jù)顯示Pfu UltraTM高保真DNA聚合酶的平均錯(cuò)配率為Pfu DNA聚合酶的1/3，為T(mén)aq DNA聚合酶的1/18，是目前保真度最高的PCR酶（保真度=1/錯(cuò)誤率） （數(shù)據(jù)來(lái)源：美國(guó)冷泉港實(shí)驗(yàn)室）。
3. Mg2+濃度也是影響反應(yīng)效率和特異性的重要因素之一。Taq DNA聚合酶對(duì)Mg2+濃度非常敏感，Mg2+可與模板DNA、引物及dNTP等的磷酸根結(jié)合，不同反應(yīng)體系中應(yīng)適當(dāng)調(diào)整MgCl2的濃度，一般以比 dNTP總濃度高出0.5~1.0mmol/L為宜，Mg2+過(guò)量能增加非特異擴(kuò)增。
4. dNTP的濃度過(guò)高會(huì)增加堿基的錯(cuò)誤摻入率，使反應(yīng)特異性下降；過(guò)低則會(huì)導(dǎo)致反應(yīng)速度下降。使用時(shí)4種dNTP必須以等當(dāng)量濃度配制，均衡的dNTP有利于減少錯(cuò)配誤差和提高使用效率。
5. 溫度循環(huán)參數(shù)中應(yīng)特別注意復(fù)性溫度，它決定引物與模板的特異性結(jié)合。退火復(fù)性溫度可根據(jù)引物的長(zhǎng)度，通過(guò)Tm=4(G+C)+2(A+T) 計(jì)算得到。在Tm允許的范圍內(nèi)，選擇較高的退火溫度可大大減少引物與模板之間的非特異結(jié)合。
6. 減低污染的常規(guī)措施：①將PCR試劑、PCR產(chǎn)物及其他分子生物學(xué)試劑分開(kāi)放置；②應(yīng)保持樣品制備、PCR反應(yīng)液配制與PCR產(chǎn)物分析三個(gè)工作區(qū)的獨(dú)立性；③使用陽(yáng)性和陰性對(duì)照；④使用最高質(zhì)量的水配制PCR實(shí)驗(yàn)的所有反應(yīng)試劑；⑤配制好的PCR反應(yīng)試劑應(yīng)分成小包裝儲(chǔ)存，每個(gè)包裝僅用于單次實(shí)驗(yàn)；⑥制備樣品、配制試劑及反應(yīng)液時(shí)必須戴手套；⑦實(shí)驗(yàn)前一定要認(rèn)真清潔加樣器等。
7.RT
在做Northern等雜交實(shí)驗(yàn)、構(gòu)建cDNA文庫(kù)、獲取能夠編碼真核生物蛋白的基因、獲得RNA病毒基因時(shí)，會(huì)用到RNA提取和RT-PCR技術(shù)。
真核生物的基因組是DNA，為什么不直接從DNA PCR得到我們需要的基因呢？因?yàn)檎婧松锏幕蚝写罅康姆蔷幋a區(qū)，稱(chēng)為內(nèi)元（intron），真正編碼蛋白的區(qū)段是被這些內(nèi)元隔開(kāi)的，這些編碼區(qū)叫做外元（exon）。真核生物的DNA轉(zhuǎn)錄成為RNA之后，經(jīng)過(guò)剪切和拼接，去掉這些非編碼區(qū)，才形成成熟的mRNA，由mRNA再翻譯成蛋白質(zhì)。
所以，如果直接從真核生物的基因組DNA獲取目的基因，克隆再表達(dá)，試圖獲取目的蛋白的思路是行不通的，因?yàn)楂@取的DNA里面會(huì)含有非編碼區(qū)。要表達(dá)真核生物的基因并表達(dá)出相應(yīng)的蛋白，只能通過(guò)提取其mRNA并RT-PCR這條頗費(fèi)周折的途徑。
1.RNA的提取 RNA的提取其實(shí)原理很簡(jiǎn)單：通過(guò)變性劑破碎細(xì)胞或者組織，然后經(jīng)過(guò)氯仿等有機(jī)溶劑抽提RNA，再經(jīng)過(guò)沉淀，洗滌，晾干，最后溶解。但是由于RNA酶無(wú)處不在，隨時(shí)可能將RNA降解，所以實(shí)驗(yàn)中有很多地方需要注意，稍有疏忽就會(huì)前功盡棄。
1.1 分離高質(zhì)量RNA 成功的cDNA合成來(lái)自高質(zhì)量的RNA。高質(zhì)量的RNA至少應(yīng)保證全長(zhǎng)并且不含逆轉(zhuǎn)錄酶的抑制劑，如EDTA或SDS。
RNA的質(zhì)量決定了你能夠轉(zhuǎn)錄到cDNA上的序列信息量的最大值。一般的RNA純化方法是使用異硫氰酸胍/酸性酚的一步法。
一般不必使用oligo(dT)選擇性分離poly(A)+RNA。不管起始模板是總RNA還是poly(A)+ RNA，都可以檢測(cè)到擴(kuò)增結(jié)果。
另外，分離poly(A)+RNA會(huì)導(dǎo)致樣品間mRNA豐度的波動(dòng)變化，從而使信息的檢出和定量產(chǎn)生偏差。然而，當(dāng)分析稀有mRNA時(shí)，poly(A)+RNA會(huì)增加檢測(cè)的靈敏度。
1.2 RNA提取的最大影響因素-RNA酶 在所有RNA實(shí)驗(yàn)中，最關(guān)鍵的因素是分離得到全長(zhǎng)的RNA。而實(shí)驗(yàn)失敗的主要原因是核糖核酸酶（RNA酶）的污染。
由于RNA酶廣泛存在而穩(wěn)定，可耐受多種處理而不被滅活，如煮沸、高壓滅菌等，RNA酶催化的反應(yīng)一般不需要輔助因子。因而RNA制劑中只要存在少量的RNA酶就會(huì)引起RNA在制備與分析過(guò)程中的降解，而所制備的RNA的純度和完整性又可直接影響RNA分析的結(jié)果，所以RNA的制備與分析操作難度極大。
在實(shí)驗(yàn)中，一方面要嚴(yán)格控制外源性RNA酶的污染；另一方面要最大限度地抑制內(nèi)源性的RNA酶。外源性的RNA酶存在于操作人員的手汗、唾液等，也可存在于灰塵中。
在其它分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)中使用的RNA酶也會(huì)造成污染。這些外源性的RNA酶可污染器械、玻璃制品、塑料制品、電泳槽、研究人員的手及各種試劑。
而各種組織和細(xì)胞中則含有大量?jī)?nèi)源性的RNA酶。 1.3 常用的RNA酶抑制劑 *焦碳酸二乙酯（DEPC）：是一種強(qiáng)烈但不徹底的RNA酶抑制劑。
它通過(guò)和RNA酶的活性基團(tuán)組氨酸的咪唑環(huán)結(jié)合使蛋白質(zhì)變性，從而抑制酶的活性。 *異硫氰酸胍：目前被認(rèn)為是最有效的RNA酶抑制劑，它在裂解組織的同時(shí)也使RNA酶失活。
它既可破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu)使核酸從核蛋白中解離出來(lái)，又對(duì)RNA酶有強(qiáng)烈的變性作用。 *氧釩核糖核苷復(fù)合物：由氧化釩離子和核苷形成的復(fù)合物，它和RNA酶結(jié)合形成過(guò)渡態(tài)類(lèi)物質(zhì)，幾乎能完全抑制RNA酶的活性。
*RNA酶的蛋白抑制劑（RNasin）：從大鼠肝或人胎盤(pán)中提取得來(lái)的酸性糖蛋白。RNasin是RNA酶的一種非競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑，可以和多種RNA酶結(jié)合，使其失活。
*其它：SDS、尿素、硅藻土等對(duì)RNA酶也有一定抑制作用。 1.4 防止RNA酶污染的措施、RNA提取之前需要注意和準(zhǔn)備的工作 *盡可能在實(shí)驗(yàn)室專(zhuān)門(mén)辟出RNA操作區(qū)，離心機(jī)、移液器、試劑等均應(yīng)專(zhuān)用。
RNA操作區(qū)應(yīng)保持清潔，并定期進(jìn)行除菌。 *操作過(guò)程中應(yīng)始終戴一次性橡膠手套和口罩，并經(jīng)常更換，以防止手、臂上的細(xì)菌和真菌以及人體自身分泌的RNase帶入各種容器內(nèi)或污染用具。
盡量避免使用一次性塑料手套。塑料手套不僅常常給操作帶來(lái)不便，而且塑料手套的多出部分常常將器具有RNase處傳遞到RNase-free處，擴(kuò)大污染。
*盡量使用一次性的塑料制品，避免共用器具如濾紙、tips、tubes等，以防交叉污染。例如，從事RNA探針工作的研究者經(jīng)常使用RNase H、T1等，在操作過(guò)程中極有可能造成移液器、離心機(jī)等的污染。
而這些污染了的器具是RNA操作的大敵。 *關(guān)于一次性塑料制品，建議使用廠家供應(yīng)的出廠前已經(jīng)滅菌的tips和tubes等。
多數(shù)廠家供應(yīng)的無(wú)菌塑料制品很少有RNase污染，買(mǎi)來(lái)后可直接用于RNA操作。用DEPC等處理的塑料制品，往往由于二次污染而帶有RNase，從而導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)失敗。
*所有的玻璃器皿均應(yīng)在使用前于180℃的高溫下干烤6hr或更長(zhǎng)時(shí)間。 *無(wú)法用DEPC處理的用具可用氯仿擦拭若干次，這樣通?？梢韵齊Nase的活性。
*配制溶液用的乙醇、異丙醇、Tris等應(yīng)采用未開(kāi)封的新瓶裝試劑。 *塑料器皿可用0.1% DEPC水浸泡或用氯仿沖洗（注意：有機(jī)玻璃器具因可被氯仿腐蝕，故不能使用）。
*有機(jī)玻璃的電泳槽等，可先用去污劑洗滌，雙蒸水沖洗，乙醇干燥，再浸泡在3% H2O2 室溫10min，然后用0.1% DEPC水沖洗，晾干。 *配制的溶液應(yīng)盡可能的用0.1% DEPC，在37℃處理。
8.PCR實(shí)驗(yàn)操作注意事項(xiàng)有哪些
1、必須在無(wú)菌無(wú)塵環(huán)境下進(jìn)行操作；
2、檢測(cè)人員必須通過(guò)國(guó)家臨檢中心業(yè)務(wù)培訓(xùn)并取得合格證書(shū)；
3、必須擁有標(biāo)準(zhǔn)的的PCR熒光實(shí)驗(yàn)室；
4、后PCR區(qū)PCR完成以后，應(yīng)該留出一個(gè)專(zhuān)門(mén)用于反應(yīng)后處理樣品的地方。
擴(kuò)展資料
PCR實(shí)驗(yàn)特點(diǎn)：
1、靈敏度高：PCR實(shí)驗(yàn)產(chǎn)物的生成量是以指數(shù)方式增加的，能從100萬(wàn)個(gè)細(xì)胞中檢出一個(gè)靶細(xì)胞；在病毒的檢測(cè)中，PCR的靈敏度可達(dá)3個(gè)RFU；在細(xì)菌學(xué)中最小檢出率為3個(gè)細(xì)菌。
2、簡(jiǎn)便、快速：PCR實(shí)驗(yàn)反應(yīng)一般在2~4 小時(shí)完成擴(kuò)增反應(yīng)。擴(kuò)增產(chǎn)物一般用電泳分析，不一定要用同位素，無(wú)放射性污染、易推廣。
3、純度要求低：不需要分離病毒或細(xì)菌及培養(yǎng)細(xì)胞，DNA 粗制品及RNA均可作為擴(kuò)增模板。可直接用臨床標(biāo)本如血液、體腔液、洗嗽液、毛發(fā)、細(xì)胞、活組織等DNA擴(kuò)增檢測(cè)。
參考資料來(lái)源：百度百科-PCR實(shí)驗(yàn)室
