蔗糖酶活力測(cè)定的(酶活力測(cè)定的注意事項(xiàng)有哪些)
1.酶活力測(cè)定的注意事項(xiàng)有哪些
注意事項(xiàng)：
1.底物濃度 除選擇適合的底物外，在實(shí)際應(yīng)用中更多考慮的是底物濃度。由于[S]與反應(yīng)速度V成雙曲線關(guān)系，在酶活性測(cè)定時(shí)，要求[S]達(dá)到一定水平以保證酶活性與酶量成正比。[S]范圍一般選擇在10~20Km為宜，此時(shí)反應(yīng)速度基本達(dá)到最大反應(yīng)速度，測(cè)定的誤差在可接受范圍。
2.酶濃度 在反應(yīng)條件一定時(shí)，酶濃度與反應(yīng)速度成正比。按照中間產(chǎn)物學(xué)說(shuō)，只有[S]>>[E]時(shí)，酶才能被底物分子飽和，反應(yīng)速度才能達(dá)到最大值。因此當(dāng)標(biāo)本酶活力過(guò)高時(shí)，應(yīng)將標(biāo)本適當(dāng)稀釋后再加以測(cè)定。
3.溫度 不同的酶最適溫度可以不同，多數(shù)酶的最適溫度在37~40℃，高于或低于最適溫度，酶活性都降低。目前，酶活性的測(cè)定溫度尚未統(tǒng)一，但常規(guī)實(shí)驗(yàn)室多使用37℃。溫度對(duì)酶促反應(yīng)的影響程度通常用溫度系數(shù)（Q10）表示。溫度系數(shù)指溫度每升高10℃，化學(xué)反應(yīng)速度增加的倍數(shù)。Q10通常為l~2。由溫度系數(shù)得知，溫度的變化對(duì)酶活性有著重要影響，因此要求酶活性測(cè)定要在恒溫條件下進(jìn)行，溫度波動(dòng)要控制在±1℃。
4.離子強(qiáng)度和pH值 在最適pH時(shí)，酶的活性最強(qiáng)，高于或低于最適pH，酶的活性都降低，多數(shù)酶的最適pH在5~8之間。在測(cè)定酶活性時(shí)，要求緩沖液具有足夠的緩沖容量，以便使pH值保持穩(wěn)定。血漿或血清標(biāo)本含有多種緩沖溶質(zhì)，具有較強(qiáng)的緩沖能力。為了防止血漿或血清標(biāo)本緩沖溶質(zhì)對(duì)反應(yīng)液酸堿度的影響，使pH不致偏離設(shè)定值，標(biāo)本用量不宜過(guò)大，血漿或血清標(biāo)本體積/反應(yīng)液體積≤1/10為宜。
5 輔助因子 某些金屬離子和維生素類輔酶是結(jié)合酶的輔助因子，例如Zn2+是羧基肽酶的輔基，Mo6+是黃嘌呤氧化酶的輔基，NADH是不需氧脫氫酶的輔酶。這些酶離開它們的輔基或輔酶就不能表現(xiàn)活性，因此在酶活性測(cè)定時(shí)，就要保證輔基或輔酶的供給。
6.激活劑 有些酶在有激活劑存在時(shí)才有活性或活性較高，例如Mg2+是肌酸激酶的激活劑，Cl-是淀粉酶的激活劑。因此在酶活性測(cè)定時(shí)，也要滿足酶對(duì)激活劑的需要。
7.抑制劑 酶的抑制可分為不可逆抑制和可逆抑制，后者又可分為競(jìng)爭(zhēng)性抑制和非競(jìng)爭(zhēng)性抑制。重金屬離子和砷化物對(duì)巰基酶的抑制、有機(jī)磷對(duì)羥基酶的抑制屬于不可逆抑制；丙二酸對(duì)琥珀酸脫氫酶的抑制、磺胺類藥物對(duì)二氫葉酸合成酶的抑制屬于競(jìng)爭(zhēng)性抑制；哇巴因?qū)a+,K+-ATP酶的抑制屬于非競(jìng)爭(zhēng)性抑制。抑制劑使酶活性降低，在測(cè)定酶活性時(shí)，應(yīng)避免抑制劑的影響。
綜上所述，測(cè)定酶活性時(shí)，最適條件的選擇應(yīng)該遵循最適底物濃度、最適溫度、最適pH值、滿足輔助因子和激活劑、避免抑制劑的原則。
2.測(cè)定酶活性時(shí)應(yīng)注意些什么?
酶的活性測(cè)定要求有適宜的特定反應(yīng)條件，應(yīng)注意影響酶促反應(yīng)速度的各種因素應(yīng)該相對(duì)恒定。
1.酶的樣品應(yīng)做適當(dāng)?shù)奶幚怼?.反應(yīng)體系中，底物的量足夠使酶被底物飽和，以充分反映待測(cè)酶的活力。
但過(guò)高的底物濃度可能抑制酶的活性，一般底物濃度在10km以上。3.測(cè)定代謝物時(shí)應(yīng)保持酶的足夠濃度。
4.應(yīng)根據(jù)反應(yīng)時(shí)間選擇反應(yīng)的最適溫度。5.根據(jù)不同的底物和緩沖液選擇反應(yīng)的最適pH。
6.為獲取最高反應(yīng)速度，在反應(yīng)體系中應(yīng)含有適宜的輔助因子，激活劑等。7.測(cè)定酶活性時(shí)應(yīng)測(cè)定酶促反應(yīng)的初速度。
3.用正交法測(cè)定幾種因素對(duì)蔗糖酶活性的影響中水平實(shí)驗(yàn)結(jié)果是什么意思
需要，舉例說(shuō)明：正交實(shí)驗(yàn)法舉例： 用正交法測(cè)定幾種因素對(duì)蔗糖酶活力的影響 目的要求 1.初步掌握正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方法的使用 2.求出蔗糖酶的最適溫度和最適pH值 實(shí)驗(yàn)原理 酶的催化作用是在一定條件下進(jìn)行的，它受多種因素的影響，如：底物濃度、酶濃度、溶液的pH值和離子濃度、溫度、抑制劑和激活劑等都能影響催化反應(yīng)的速度。
通常是在其他因素恒定的條件下，通過(guò)對(duì)某因素在一系列變化條件下的酶活性測(cè)定，求得該因素對(duì)酶活力的影響，這是單因素的簡(jiǎn)單比較法。 本實(shí)驗(yàn)用正交法測(cè)定溫度、pH值、底物濃度和酶濃度四種因素對(duì)蔗糖酶活性的影響，這是多因素（≥3）的實(shí)驗(yàn)方法。
正交法是通過(guò)正交表安排多因素實(shí)驗(yàn)，利用統(tǒng)計(jì)數(shù)學(xué)原理進(jìn)行數(shù)據(jù) 分析的一種科學(xué)方法，它符合“以盡量少的試驗(yàn)，獲得足夠的、有效的信 息”的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)原則。正交試驗(yàn)法的程序?yàn)橄铝邪藗€(gè)步驟： （1）確定試驗(yàn)?zāi)康摹?/p>
實(shí)驗(yàn)?zāi)康氖嵌喾N多樣的，如找出產(chǎn)品質(zhì)量指標(biāo)的最佳組合、確定最佳工藝條件等。本實(shí)驗(yàn)的目的是為了提高酶的反應(yīng)速度，提高酶的活力。
（2）選擇質(zhì)量特性指標(biāo)。應(yīng)選擇能提高或改進(jìn)的質(zhì)量特性及因素效應(yīng)。
對(duì)于本實(shí)驗(yàn)來(lái)說(shuō)就是產(chǎn)物（葡萄糖）生成量的多少。 （3）選定相關(guān)因素。
即選擇和確定可能對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果或質(zhì)量特性值有影響的那些因素，可人為控制與調(diào)節(jié)的因素，如溫度、pH等。這些因素之間有相互獨(dú)立性。
（4）確定水平。水平，又稱位級(jí)，是因素的一個(gè)給定值或一種特定的措施，或一種特定的狀態(tài)。
水平也就是因素變化的各種狀態(tài)。在確定水平時(shí)，應(yīng)考慮選擇范圍、水平數(shù)和水平位置。
如本實(shí)驗(yàn)的溫度水平可以選擇20℃、30 ℃、50 ℃三個(gè)水平。 （5）選用正交表。
應(yīng)從因素?cái)?shù)、水平數(shù)以及有無(wú)重點(diǎn)因素需要強(qiáng)化考察等各方面綜合考慮選用正交表。一般情況下，首先根據(jù)水平數(shù)選用2或3系列表，然后，以容納試驗(yàn)因素?cái)?shù)，選用實(shí)驗(yàn)次數(shù)最少的正交表。
如有重點(diǎn)考察的因素，則根據(jù)其多考察的水平數(shù)，選混合型正交表。 （6）配列因素水平，制定實(shí)驗(yàn)方案。
按隨機(jī)原則，把因素配列于選用的正交表中，制定實(shí)驗(yàn)的順序、時(shí)間等，即制定實(shí)驗(yàn)具體方案。 （7）實(shí)施實(shí)驗(yàn)方案。
按實(shí)驗(yàn)方案，認(rèn)真、正確地試驗(yàn)，如實(shí)記錄各種實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。 （8）實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析。
對(duì)實(shí)驗(yàn)中取得的各種數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。如從數(shù)據(jù)中直接選出符合或接近質(zhì)量特性期望值的實(shí)驗(yàn)條件組。
如不能采用直觀分析方法，則應(yīng)采用其他分析方法，確定各因素主次地位可用極差分析方法，定量分析各個(gè)因素對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響程度，則用方差分析方法。 操作方法 1.實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)： 1）確定指標(biāo)：即實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。
本實(shí)驗(yàn)的指標(biāo)是酶活力。這里，用A520值表示。
2）制定因素水平表：考察四個(gè)因素（溫度、pH值、底物濃度和酶濃度），每個(gè)因素取三個(gè)水平（如溫度選擇20℃、35 ℃ 和50 ℃ 三個(gè)水平）。水平是因素變化的范圍（通常是根據(jù)專業(yè)知識(shí)確定。
如無(wú)資料可借鑒，應(yīng)先加寬范圍再逐步縮小）內(nèi)要進(jìn)行實(shí)驗(yàn)的具體條件，如表1。 表1 因素水平表 3）選擇正交表：可容納三因素三水平的正交表有L9(34)、L27(313)、L18(36*6)和L27(38*9)。
本實(shí)驗(yàn)不考察各因素間的交互作用，也沒(méi)設(shè)計(jì)混合水平，只有水平數(shù)均為3的的四個(gè)因素，故選用L9(34)表，見表2。 分析： A. 判斷各因素的水平范圍是否選偏； B. 判斷各因素顯著性大小的順序； C. 判斷實(shí)驗(yàn)結(jié)果的置信度。
實(shí)驗(yàn)安排 具體操作步驟： 1、將已配制好的三種不同pH的0.2mol/L的緩沖液于試管中。 2、將酶粉用蒸餾水溶解（適當(dāng)體積10-30ml不等），離心去 除不溶物，10,000rpm/min,10min,4℃。
3、酶活預(yù)示實(shí)驗(yàn)，確定酶的稀釋倍數(shù)。（可根據(jù)產(chǎn)物稀釋的 倍數(shù)來(lái)確定酶的稀釋倍數(shù)）A520在0.4-2.0之間即可。
4、準(zhǔn)備10支試管。其中一支為“0”號(hào)管，作為測(cè)量時(shí)的參 比溶液。
其他九支試管根據(jù)前面的圖表3加入相關(guān)的溶 液，分別在不同的條件下進(jìn)行酶反應(yīng)。利用二硝基水楊酸 的方法測(cè)定不同管在A520下的光密度值。
5、計(jì)算同一因素不同水平的級(jí)差，級(jí)差小代表離散度小， 表示該水平為酶反應(yīng)的最適條件。 1）數(shù)據(jù)記錄：將上述兩組平行實(shí)驗(yàn)的結(jié)果取平均值后的9個(gè)數(shù)據(jù)，填入表4中的Yi項(xiàng)內(nèi)。
2）數(shù)據(jù)整理及分析：對(duì)于一般的實(shí)驗(yàn)，可用極差分析，該分析方法簡(jiǎn)單、直觀。對(duì)要求精細(xì)的實(shí)驗(yàn)，則要用方差分析，該方法可給出誤差的大小估計(jì)，但有一定的計(jì)算量。
對(duì)于有混合水平的正交實(shí)驗(yàn)，只能用方差分析。
4.影響酶活性的因素實(shí)驗(yàn)應(yīng)注意什么
(1)酶促反應(yīng)過(guò)程中，只有最初一段時(shí)間內(nèi)反應(yīng)速度與酶濃度成正比，隨著反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)，反應(yīng)速度即逐漸降低。
(2)要規(guī)定一定的反應(yīng)條件，如時(shí)間、溫度、pH等，并在酶測(cè)定過(guò)程中保持這些反應(yīng)條件的恒定，如溫度不得超過(guò)規(guī)定溫度的士1℃，pH應(yīng)恒定。
(3)配制的底物濃度應(yīng)準(zhǔn)確且足夠大，底物液中應(yīng)加入不抑制該酶活力的防腐劑并保存于冰箱中，以防止底物被分解。
(4)標(biāo)本要新鮮，由于絕大多數(shù)酶可因久置而活力降低，標(biāo)本如無(wú)法及時(shí)測(cè)定，應(yīng)保存于冰箱中。用血漿時(shí)，應(yīng)考慮到抗凝劑對(duì)酶反應(yīng)的影響。有些酶在血細(xì)胞、血小板中的濃度比血清高，為此在采血、分離血清時(shí)，應(yīng)注意防止溶血和白細(xì)胞的破裂。
(5)在測(cè)定過(guò)程中，所用儀器應(yīng)絕對(duì)清潔，不應(yīng)含有酶的抑制物，如酸、堿、蛋白沉淀劑等。
