培養(yǎng)基的制備實驗中用到的消毒方法?(培養(yǎng)基滅菌的方法)
1.培養(yǎng)基滅菌的方法有哪些
培養(yǎng)基的滅菌方法
1、高壓蒸汽滅菌：
高壓蒸汽滅菌適合于耐高溫培養(yǎng)基、接種器械和蒸餾水的滅菌。培養(yǎng)基在愛制備過程中混入各種雜菌，分裝后應立即滅菌，至少應在24h內(nèi)完成滅菌工作。滅菌時一般是在0.105MPa壓力下，溫度121℃時，滅菌15~30min即可。消毒時間不宜過長，也不能超過規(guī)定的壓力范圍，否則有機物質(zhì)特別是維生素類物質(zhì)就會在高溫下分解，失去營養(yǎng)作用，也會使培養(yǎng)基變質(zhì)、變色，甚至難以凝固。將蒸餾水或自來水裝在三角瓶中，裝水量一般不超過瓶的2/3，用牛皮紙或硫酸紙包扎封口，然后放入高壓鍋中滅菌后即為無菌水。 滅菌后的培養(yǎng)基可放到培養(yǎng)室中預培養(yǎng)3d，若無污染現(xiàn)象，則證明滅菌是徹底的，可以使用。暫時不用的培養(yǎng)基最好置于10℃下保存。含IAA或GA3的培養(yǎng)基應在1周內(nèi)用完，其他培養(yǎng)基最多也不要超過1個月。
2、過濾滅菌：
一些植物生長調(diào)節(jié)劑及有機物，如IAA、GA3、ZT、CM等，遇熱容易分解，不能與培養(yǎng)基一起進行高溫滅菌，而要使用細菌過濾器濾去其中的雜菌。細菌過濾器與濾膜（孔徑0.45微米）使用之前要先進行高壓滅菌。過濾后的溶液要立即加入培養(yǎng)基中，若為液體培養(yǎng)基，可在培養(yǎng)基冷卻至30℃時加入；若為固體培養(yǎng)基，必須在培養(yǎng)基凝固之前（50-60℃）加入，振蕩使溶液與其他成分混合均勻。
2.培養(yǎng)基滅菌的方法有哪些
培養(yǎng)基的滅菌方法 1、高壓蒸汽滅菌：高壓蒸汽滅菌適合于耐高溫培養(yǎng)基、接種器械和蒸餾水的滅菌。
培養(yǎng)基在愛制備過程中混入各種雜菌，分裝后應立即滅菌，至少應在24h內(nèi)完成滅菌工作。滅菌時一般是在0.105MPa壓力下，溫度121℃時，滅菌15~30min即可。
消毒時間不宜過長，也不能超過規(guī)定的壓力范圍，否則有機物質(zhì)特別是維生素類物質(zhì)就會在高溫下分解，失去營養(yǎng)作用，也會使培養(yǎng)基變質(zhì)、變色，甚至難以凝固。將蒸餾水或自來水裝在三角瓶中，裝水量一般不超過瓶的2/3，用牛皮紙或硫酸紙包扎封口，然后放入高壓鍋中滅菌后即為無菌水。
滅菌后的培養(yǎng)基可放到培養(yǎng)室中預培養(yǎng)3d，若無污染現(xiàn)象，則證明滅菌是徹底的，可以使用。暫時不用的培養(yǎng)基最好置于10℃下保存。
含IAA或GA3的培養(yǎng)基應在1周內(nèi)用完，其他培養(yǎng)基最多也不要超過1個月。2、過濾滅菌：一些植物生長調(diào)節(jié)劑及有機物，如IAA、GA3、ZT、CM等，遇熱容易分解，不能與培養(yǎng)基一起進行高溫滅菌，而要使用細菌過濾器濾去其中的雜菌。
細菌過濾器與濾膜（孔徑0.45微米）使用之前要先進行高壓滅菌。過濾后的溶液要立即加入培養(yǎng)基中，若為液體培養(yǎng)基，可在培養(yǎng)基冷卻至30℃時加入；若為固體培養(yǎng)基，必須在培養(yǎng)基凝固之前（50-60℃）加入，振蕩使溶液與其他成分混合均勻。
3.培養(yǎng)基的制備與滅菌的實驗中配制培養(yǎng)基時要注意哪些問題
1、常用玻璃儀器的準備 制備培養(yǎng)基所用的吸管、錐形瓶、毛細吸管、平皿等玻璃儀器用前要用肥皂水洗刷后用清水沖洗干凈，晾干后備用.（1）平皿用紙或布包好，或裝在金屬盒內(nèi)，于121℃高壓蒸汽菌3min后烘干，備用.（2）試管管口用棉花塞或硅氟塑料試管塞塞好，再用布或報紙包扎好，121℃高壓蒸汽滅菌20℃后烘干，備用.（3）吸管及滴管先用少許棉花塞于吸口端（防止污染物吸出，或橡皮帽內(nèi)的氣體污染），然后用紙包后或裝入金屬吸管筒內(nèi)，于121℃高壓蒸汽滅菌20min后烘干，備用.其他玻璃器皿均應按上法處理，也應裝金屬筒內(nèi)160℃干熱滅菌2h后，備用.2、培養(yǎng)基的制備及儲存 （1）溶化：一般應放在玻璃器皿或搪瓷齊內(nèi).加入蒸餾水，隔水加熱以促其溶解，加熱時應經(jīng)常攪拌，防止焦結，待其溶解后補足水分.在使用干燥培養(yǎng)基時，先將蒸餾水按定量加入容器中，然后稱取一定量培養(yǎng)基干粉放入水中，靜置10—15min，攪拌，振蕩，或延長時間以促進溶解，一般不要熱，必要時加熱，但時間不宜過長，溫度不宜過高，避免某些營養(yǎng)成分被破壞.（2）校正酸堿度（調(diào)節(jié)pH）：培養(yǎng)基必須有適當?shù)膒H.因此測定pH是培養(yǎng)基配制過程中的重要步驟之一，測定pH的標準溫度為25士2℃.調(diào)節(jié)pH可用無菌的1mol/l氫氧化鈉溶液或10%碳酸鈉溶液、1mol/l鹽酸溶液.當調(diào)節(jié)緩沖液的pH時，宜用6mol/l磷酸或10mol/l氫氧化鉀溶液.滅菌后的pH會比滅菌前的pH升高或降低，一般高壓滅菌前培養(yǎng)基的pH會比最終pH調(diào)高0.2左右，滅菌后基本合適.因此對培養(yǎng)基、緩沖液、試劑在滅菌前后的pH均進行測定，并記下每次pH的測定結果，有助于積累數(shù)據(jù)考察每種培養(yǎng)基、緩沖液、試劑對滅菌程序的耐受性，從而指導滅菌前pH的調(diào)節(jié).干燥培養(yǎng)基一般已校正過pH，用時也必須再驗證.測定時，一般用指示劑滴入培養(yǎng)基觀察其顏色的變化，或用pH計校正，如與所需pH不符，可用以上的酸或堿液加以校正.調(diào)整pH后要加熱過濾，使培養(yǎng)基澄清.（3）培養(yǎng)基的分裝：大批量配制時使用的自動分配器須經(jīng)校準和確認.每次使用前后，均要對分配器的管道系統(tǒng)進行沖洗，在分裝無菌培養(yǎng)基前，則要采用無菌硅膠管.固體培養(yǎng)基一般分裝在250ml、500ml錐形瓶中，高壓滅菌后根據(jù)需要分裝平皿或試管.平皿：傾注平皿，應在無菌室中放置3—4h，如用塑料平皿須在35℃培養(yǎng)箱 中倒置30—60min.讓水蒸汽自然蒸發(fā).斜面：制備低層斜面分裝于試管，約占容積1/5，滅菌后趁熱斜放在細玻璃棒和木桿上，使成斜度，分裝使注意管口和瓶塞上勿沾有培養(yǎng)基，如沾有培養(yǎng)基應用布抹去，以避免污染.高層斜面：制備高層斜面分裝于試管，約占試管容積的1/3，滅菌后趁熱放置成高層短斜面，待其凝固后應用.分裝好的培養(yǎng)基或緩沖液等及時密封后必須在配制當天（2h內(nèi)最佳）進行滅菌處理.液體、半固體培養(yǎng)基一般在高壓滅前分裝，約裝試管容積的1/3，在滅菌后還要加其他成分的液體、半固體培養(yǎng)基，滅菌后再分裝于滅菌試管或錐形瓶中.培養(yǎng)基的滅菌：培養(yǎng)基的滅菌多采用高壓蒸汽滅菌，各種培養(yǎng)基的滅菌時間和壓力，按其成分不同而定.普通培養(yǎng)基采用121℃、103.42kPa滅菌15min，但容器和裝量較大時，應延長至20min.含糖培養(yǎng)基115℃、68.85kPa滅菌30min.含糖、血清、雞蛋等培養(yǎng)基可用流動蒸汽及血清凝固器80—100℃、30min，連續(xù)3d，間歇滅菌.血清或組織液，采用低熱56—58水浴1h，連續(xù)5—6d滅菌，一些遇高溫即被破壞的物質(zhì)如尿素、腹水等，可用細菌過濾器，過濾除菌.高壓滅菌應嚴格按照操作規(guī)程執(zhí)行，必須逐漸加熱，徹底排除滅菌器內(nèi)的空氣，再逐漸升壓保持預定的壓力和時間，達到全部殺滅微生物.以上的滅菌時間和溫度要經(jīng)過驗證確認，如不同類型培養(yǎng)基混合一起滅菌時宜采用115℃、68.85kPa滅菌30min為好.。
4.微生物中的培養(yǎng)基的配制與滅菌的具體操作是怎樣的
培養(yǎng)基的配制與滅菌 1目的1.1了解并掌握培養(yǎng)基的配制、分裝方法1.2掌握各種實驗室滅菌方法及技術。
2原理 培養(yǎng)基是供微生物生長、繁殖、代謝的混合養(yǎng)料。由于微生物具有不同的營養(yǎng)類型，對營養(yǎng)物質(zhì)的要求也各不相同，加之實驗和研究的目的不同，所以培養(yǎng)基的種類很多，使用的原料也各有差異，但從營養(yǎng)角度分析，培養(yǎng)基中一般含有微生物所必需的碳源、氮源、無機鹽、生長素以及水分等。
另外，培養(yǎng)基還應具有適宜的pH值、一定的緩沖能力、一定的氧化還原電位及合適的滲透壓。瓊脂是從石花菜等海藻中提取的膠體物質(zhì)，是應用最廣的凝固劑。
加瓊脂制成的培養(yǎng)基在98~100℃下融化，于45℃以下凝固。但多次反復融化，其凝固性降低。
任何一種培養(yǎng)基一經(jīng)制成就應及時徹底滅菌，以備純培養(yǎng)用。一般培養(yǎng)基的滅菌采用高壓蒸汽滅菌。
3材料3.1器皿及材料 天平、稱量紙、牛角匙、精密pH試紙、量筒、刻度搪瓷杯、試管、三角瓶、漏斗、分裝架、移液管及移液管筒、培養(yǎng)皿及培養(yǎng)皿盒、玻璃棒、燒杯、試管架、鐵絲筐、剪刀、酒精燈、棉花、線繩、牛皮紙或報紙、紗布、乳膠管、電爐、滅菌鍋、干燥箱。3.2藥品試劑 蛋白胨、牛肉膏、NaCl、K2HPO4、瓊脂、NaNO3、KCl、MgSO4、FeSO4、蔗糖、麥芽糖、木糖、葡萄糖、半乳糖、乳糖、土豆汁、豆芽計、磷酸銨、5%NaOH溶液、5%HCl溶液。
4流程 稱藥品→溶解→調(diào)pH值→融化瓊脂→過濾分裝→包扎標記→滅菌→擺斜面或倒平板。5步驟5.1培養(yǎng)基的制備5.1.1稱量藥品 根據(jù)培養(yǎng)基配方依次準確稱取各種藥品，放入適當大小的燒杯中，瓊脂不要加入。
蛋白胨極易吸潮，故稱量時要迅速。5.1.2溶解 用量筒取一定量（約占總量的1/2）蒸餾水倒入燒杯中，在放有石棉網(wǎng)的電爐上小火加熱，并用玻棒攪拌，以防液體溢出。
待各種藥品完全溶解后，停止加熱，補足水分。如果配方中有淀粉，則先將淀粉用少量冷水調(diào)成糊狀，并在火上加熱攪拌，然后加足水分及其它原料，待完全溶化后，補足水分。
5.1.3調(diào)節(jié)pH 根據(jù)培養(yǎng)基對pH的要求，用5%NaOH或5%HC1溶液調(diào)至所需pH。測定pH可用pH試紙或酸度計等。
5.1.4溶化瓊脂 固體或半固體培養(yǎng)基須加入一定量瓊脂。瓊脂加入后，置電爐上一面攪拌一面加熱，直至瓊脂完全融化后才能停止攪拌，并補足水分（水需預熱）。
注意控制火力不要使培養(yǎng)基溢出或燒焦。5.1.5過濾分裝 先將過濾裝置安裝好（圖3-1）。
如果是液體培養(yǎng)基，玻璃漏斗中放一層濾紙，如果是固體或半固體培養(yǎng)基，則需在漏斗中放多層紗布，或兩層紗布夾一層薄薄的脫脂棉趁熱進行過濾。過濾后立即進行分裝。
分裝時注意不要使培養(yǎng)基沾染在管口或瓶口，以免浸濕棉塞， 引起污染。液體分裝高度以試管高度的1/4左右為宜。
固體分裝裝量為管高的1/5，半固體分裝試管一般以試管高度的1/3為宜；分裝三角瓶，其裝量以不超過三角瓶容積的一半為宜。5.1.6包扎標記 培養(yǎng)基分裝后加好棉塞或試管帽，再包上一層防潮紙，用棉繩系好。
在包裝紙上標明培養(yǎng)基名稱，制備組別和姓名、日期等。5.1.7滅菌 上述培養(yǎng)基應按培養(yǎng)基配方中規(guī)定的條件及時進行滅菌。
普通培養(yǎng)基為121℃20min，以保證滅菌效果和不損傷培養(yǎng)基的有效成份。培養(yǎng)基經(jīng)滅菌后，如需要作斜面固體培養(yǎng)基，則滅菌后立即擺放成斜面（圖3-2），斜面長度一般以不超過試管長度的1/2為宜；半固體培養(yǎng)基滅菌后，垂直冷凝成半固體深層瓊脂。
5.1.8倒平板 將需倒平板的培養(yǎng)基，于水浴鍋中冷卻到45~50℃，立刻倒平板。5.2滅菌方法 滅菌是指殺死或消滅一定環(huán)境中的所有微生物，滅菌的方法分物理和化學滅菌法兩大類。
本實驗主要介紹物理方法的一種，即加熱滅菌。加熱滅菌包括濕熱和干熱滅菌兩種。
通過加熱使菌體內(nèi)蛋白質(zhì)凝固變性，從而達到殺菌目的。蛋白質(zhì)的凝固變性與其自身含水量有關，含水量越高，其凝固所需要的溫度越低。
在同一溫度下，濕熱的殺菌效力比干熱大，因為在濕熱情況下，菌體吸收水分，使蛋白質(zhì)易于凝固；同時濕熱的穿透力強，可增加滅菌效力。5.2.1.高壓蒸汽滅菌法 高壓蒸汽滅菌用途廣，效率高，是微生物學實驗中最常用的滅菌方法。
這種滅菌方法是基于水的沸點隨著蒸汽壓力的升高而升高的原理設計的。當蒸汽壓力達到1.05kg/cm2時，水蒸氣的溫度升高到121℃，經(jīng)15~30min，可全部殺死鍋內(nèi)物品上的各種微生物和它們的孢子或芽孢。
一般培養(yǎng)基、玻璃器皿以及傳染性標本和工作服等都可應用此法滅菌（圖3-4）。5.2.1.1操作方法和注意事項如下 加水 打開滅菌鍋蓋，向鍋內(nèi)加水到水位線。
立式消毒鍋最好用已煮開過的水，以便減少水垢在鍋內(nèi)的積存。注意水要加夠，防止滅菌過程中干鍋。
裝料、加蓋 滅菌材料放好后，關閉滅菌器蓋，采用對角式均勻擰緊鍋蓋上的螺旋，使蒸汽鍋密閉，勿使漏氣。排氣 打開排氣口（也叫放氣閥）。
用電爐加熱，待水煮沸后，水蒸氣和空氣一起從排氣孔排出，當有大量蒸汽排出時，維持5min，使鍋內(nèi)冷空氣完全排凈。升壓、保壓和降壓 當鍋內(nèi)冷空氣排凈時，即可關閉排氣閥，壓力開始上升。
當壓力上升至所需壓力時，控制電壓以維持恒溫，并開始計算滅菌時間，待時間達。
5.實驗室常用的滅菌方法有哪些
(1)加熱滅菌法 利用高溫來殺死微生物（超過最高生長溫度）的方法。
加熱滅菌的原理：當高溫作用于微生物時，首先引起細胞內(nèi)生理生化反應速率加快，機體內(nèi)對溫度敏感的物質(zhì)如蛋白質(zhì)、核酸等，隨著溫度的增高而遭受不可逆的破壞，盡而導致細胞內(nèi)原生質(zhì)體的變化、酶結構的破壞，從而使細胞失去了生活機能上的協(xié)調(diào)，停止了生長發(fā)育。隨著高溫的繼續(xù)作用，細胞內(nèi)原生質(zhì)便發(fā)生凝固，酶結構完全破壞，活動消失，生化反應停止，滲透交換等新陳代謝活動消失，細胞死亡。
加熱滅菌可分干熱滅菌和濕熱滅菌兩大類。 1）干熱滅菌 利用灼燒或干熱空氣滅菌而沒有飽和水蒸氣參加的滅菌法稱為干熱滅菌法。
由于干熱滅菌使用方便，方法簡單，故在生產(chǎn)上廣泛應用。如火焰滅菌法：直接利用火焰把微生物燒死，故又稱焚燒滅菌法。
采用此法滅菌既徹底又迅速，但只適用于金屬制的接種工具、試管口及污染物品等的處理。熱空氣滅菌法：即在電熱恒溫干燥箱中利用干熱空氣來滅菌。
2）濕熱滅菌 即利用蒸汽進行滅菌的方法。濕熱滅菌又分為高壓、常壓、間歇滅菌和巴氏滅菌4種。
①高壓蒸汽滅菌 由于高壓蒸汽具有較強的穿透力和較常壓高的溫度，能大大縮短滅菌時間，提高工作效率，加之蛋白質(zhì)在濕熱條件下容易變性，在熱蒸汽條件下，細菌的芽孢在120℃，經(jīng)20~30分鐘可全部被殺死。如滅菌材料體積較大，不易被穿透時，可將壓力增加到0.152兆帕，延長至1~2小時。
在高壓蒸汽滅菌中，滅菌溫度隨蒸汽壓力的增加而升高（圖2-6）。 圖2-6 高壓蒸汽滅菌鍋 在使用高壓滅菌鍋時，要完全排出鍋內(nèi)的空氣而以飽和蒸汽代之。
如果空氣不排除干凈，則鍋內(nèi)溫度將低于同樣壓力下由純飽和蒸汽產(chǎn)生的溫度，影響滅菌效果。 此法適用于各種耐熱物品的滅菌，如一般培養(yǎng)基、生理鹽水等各種溶液、玻璃器皿、工作服等。
所采用的蒸汽壓力與時間，應根據(jù)待滅菌物品的性質(zhì)、體積與容器類型等決定。 ②常壓蒸汽滅菌 這是采用自然壓力、100℃蒸汽進行滅菌的方法。
它設備簡單、成本低，當前使用最廣泛。只要砌一個爐灶，買1~2只大鍋，上面用磚和水泥砌成，也可用大鐵桶、木桶等，體積大小可自行決定，但不宜過大，以裝800~1500瓶為好。
設計常壓灶時應注意的問題：大小根據(jù)生產(chǎn)規(guī)模來定，灶頂部最好制成拱圓形，這樣冷凝水可沿灶的內(nèi)壁下流而不會打濕棉塞；灶倉內(nèi)要有層架結構，以便分層裝入滅菌物；灶上應安裝溫度計，可隨時觀察灶內(nèi)溫度的變化；因滅菌時間長，鍋內(nèi)水不夠蒸發(fā)，故容量大的灶要安裝加水裝置；灶倉的密閉程度要盡可能高，這樣既提高滅菌效果，又節(jié)省燃料。菇農(nóng)在生產(chǎn)中還常用一種小型蒸汽發(fā)生裝置，引出蒸汽后直接通到下邊用木條塹起、四周用多層塑料布密封的菌袋堆中進行常壓滅菌。
這種方法不用建灶，簡便省工（圖2-7）。常壓滅菌一般水燒開后保持8~10小時，悶一夜即可。
圖2-7 簡易常壓滅菌法 ③常壓間歇蒸汽滅菌法 這是利用常壓蒸汽反復幾次滅菌的方法。具體做法是將待滅菌物品放在鍋內(nèi)，100℃處理1小時左右，殺死微生物的營養(yǎng)細胞，讓其冷卻至30℃左右，此時芽胞會萌發(fā)，再以同樣方法加熱處理，反復3次，可達到滅菌目的。
該方法可用于不耐高溫的藥品、營養(yǎng)物、特殊培養(yǎng)基的滅菌。 ④低溫巴氏滅菌法 即在60~70℃下，經(jīng)一定時間，殺死有害微生物的方法。
適應于不耐高溫的物品消毒。有些培養(yǎng)基，在高溫下遭到破壞，用此法既可殺死致病微生物的營養(yǎng)體，又能使培養(yǎng)基的成分不致受到嚴重破壞。
食用菌生產(chǎn)中培養(yǎng)料堆積發(fā)酵工藝，就是利用這個原理殺死其中的病蟲、雜菌。 （2）過濾除菌法 又分液體過濾和空氣過濾兩種，就是采用機械的方法，設計一種濾孔比細菌還小的篩子，做成各種過濾器，通過機械過濾，只讓液體培養(yǎng)基或空氣從篩孔流出，各種微生物菌體則留在篩子上，從而達到除菌的目的。
這種方法適用于對熱不穩(wěn)定的體積小的液體培養(yǎng)基（如動物血清、蛋白質(zhì)、酶、維生素等）及氣體的滅菌。超凈工作臺的工作原理就是將帶菌空氣通過過濾滅菌形成無菌空氣，從風洞中吹出，來造成工作臺范圍的無菌狀態(tài)。
過濾滅菌的最大優(yōu)點是不破壞培養(yǎng)基中各種物質(zhì)的化學成分。常用的過濾器有用硅藻土制的、石棉制的、陶瓷土制的，也有用火棉膠、硝化纖維素濾膜制成的。
（3）輻射滅菌法 利用輻射產(chǎn)生的能量進行殺菌的方法稱輻射滅菌。輻射可分電離輻射和非電離輻射兩種，α-射線、β-射線、γ-射線、X-射線、中子和質(zhì)子、微波等屬電離輻射，紫外線、臭氧、日光為非電離輻射。
1）紫外線滅菌 紫外線殺菌的原理是利用紫外線的輻射作用。用燈管直接照射細菌使其發(fā)生光化學反應，將細菌細胞質(zhì)誘導形成胸腺嘧啶雙聚體，從而抑制DNA的復制而發(fā)生變性、致死。
另一方面，空氣在紫外線照射下產(chǎn)生的臭氧（O3），也具有一定的殺菌作用。紫外線的有效作用距離為1.2~2.0米。
紫外燈一般懸吊在接種室或培養(yǎng)室的上方，個數(shù)依房間大小而定，容1~2個人操作的接種室，安裝一個30瓦的紫外燈就可以了。在每次接種前，應將所需的器具一起放入接種室（箱）內(nèi)，然后打開紫外燈照射。
如果接種室體積較大，開燈照射2小時。
