電泳實驗應該(聚丙烯酰胺凝膠電泳實驗操作過程中,應注意哪些事項?)
1.聚丙烯酰胺凝膠電泳實驗操作過程中,應注意哪些事項?
一、凝膠制備時：TEMED和AP要后加，加入后用玻棒緩慢勻速的混勻，避免有氣泡產生；然后馬上注入電泳槽內，插入梳子，這時也要勻速，但不能太慢，因為太慢的話底部的膠會比上面的膠凝的快，影響膠的質量，同時小心有氣泡；
二、加樣時要注意：1.每空的上樣量不能過大，以免樣品溢出，造成各泳道相互污染；
2.為了避免邊緣效應，在未加樣的泳道加入等量的樣品緩沖液。注意事項
(1)由于與凝膠聚合有關的硅橡膠稱、玻璃板表面不光滑潔凈，在電泳時會造成凝膠板與玻璃板或硅橡膠條剝離，產生氣泡或滑膠；剝膠時凝膠板易斷裂，為防止引現(xiàn)象，所用器材均應嚴格地清洗。硅橡膠條的凹槽、樣品槽模板及電泳槽用泡沫海綿蘸取“洗潔凈”仔細清洗。玻璃板浸泡在重鉻酸鉀洗液3~4h或0.2mol/L KOH的酒精溶液中20min以上，用清水洗凈，再用泡沫海綿蘸取“洗潔凈”反復刷洗，最后用蒸餾水沖洗，直接陰干或用乙醇沖洗后陰干。
(2)安裝電泳槽和鑲有長、短玻璃板的硅橡膠框時，位置要端正，均勻用力旋緊固定螺絲，以免緩沖液滲漏。樣品槽板梳齒應平整光滑。
(3)在不連續(xù)電泳體系中，預電泳只能在分離膠鄉(xiāng)合后進行。洗凈膠面后才能制備濃縮膠。濃縮膠制備后，不能進行預電泳，以充分利用濃縮膠的濃縮效應。
(4)電泳時，電泳儀與電泳槽間正、負極不能接錯，以免樣品反方向泳動，電泳時應選用合適的電流、電壓，過高或過低無可影響電泳效果。
(5)SDS純度：在SDS-PAGE中，需高純度的SDS，市售化學純SDS需重結晶一次或兩次方可使用。重結晶方法如下：稱20g SDS放在圓底燒瓶中，加300ml無水乙醇及約半牛角匙活性碳，在燒瓶上接一冷凝管，在水浴中加熱至乙醇微沸，回流約10min，用熱布氏漏斗趁熱過濾。濾液應透明，冷卻至室溫后，移至-20℃冰箱中過夜。次日用預冷的布氏漏斗抽濾，再用少量-20℃預冷的無水乙醇洗滌白色沉淀3次，盡量抽干，將白色結晶置真空干燥器中干燥或置40℃以下的烘箱中烘干。
(6)用SDS處理蛋白質樣品時，每次都會在沸水溶中保溫3~5min，以免有亞穩(wěn)聚合物存在。
(7)標準蛋白質的相對遷移率最好在0.2~0.8之間均勻分布。值得指出的是，每次測定未知物分子量時，都應同時用標準蛋白制備標準曲線，而不是利用過去的標準曲線。用此法測定的分子量只是它們的亞基或單條肽鏈的分子量，而不是完整的分子量。為測得精確的分子量范圍，最好用其他測定蛋白分子量的方法加以校正。此法對球蛋白及纖維狀蛋白的分子量測定較好，對糖蛋白，膠原蛋白等分子量測定差異較大。
(8)對樣品的要求：應采納低離子強度的樣品。如樣品中離子強度高，則應透析或經離子交換除鹽。加樣時，應保持凹形加樣槽膠面平直。加樣量以10~15μl為宜，如樣品系較稀的液體狀，為保證區(qū)帶清晰，加樣量可增加，同時應將樣品溶解液濃度提高二倍或更高。
(9)由于凝膠中含SDS，直接制備干板會產生龜裂現(xiàn)象。如需制干板，則用25%異丙醇內含7%乙酸浸泡，并經常換液，直到SDS脫盡（約需2~3天），才可制備干板。為方便起見，常采用照像法，保存照片。
2.核酸凝膠電泳實驗需要注意什么
1、加樣時槍頭不要碰壞孔壁，否則DNA帶型不整齊。大多情況下，加樣時不必更換槍頭，可在陰極槽中反復吸打電泳緩沖液清洗，但對Southern 印跡轉移和需回收DNA時，應每個樣品使用新的槍頭，以避免樣品交叉污染。
2、上樣緩沖液不僅提高樣品的密度，使樣品均勻沉到樣孔底，還使樣品帶色，便于上樣，估計電泳時間和判斷電泳位置。
3、EB是一種強烈誘變劑并有中度毒性，應戴手套操作，對于含有EB的溶液也不應直接倒下水道，用后妥善凈化處理：EB含量大于0.5μg/ml溶 液先用水將EB濃度稀釋至0.5μg/ml以下，每100ml溶液加入100mg活性碳，不時輕輕搖蕩混勻，室溫放置1小時，濾紙過濾將活性碳與濾紙密封在塑料袋中作為有害廢物丟棄。或用專用一次性染料清除袋（Gene有限公司）吸附過夜，再焚燒袋子即 可。
4、應在暗箱窗口觀察結果，避免紫外線操作者的損傷。
5、電泳過程中，EB向陰極移動（與DNA相反），延長電泳時間，EB會從凝膠中遷移出來，從而使小片段DNA難于檢測，可將凝膠浸在 0.5μg/ml EB溶液中重新染色后檢測。
6、加樣孔的加樣量依DNA樣品中片段的數(shù)量及大小而定，通常對0.5cm寬的加樣孔，DNA上樣量在0.1~0.5μg即可有良好的觀察效果。如 樣品為酶切產物（由大小不同的DNA片段組成），每孔加20~30μg DNA也不致明顯影響分辨率。
7、小的凝膠——微型凝膠和中型凝膠的電泳一般比大的凝膠要快，常常用于快速分析。當選擇微型或中型凝膠裝置時要考慮凝膠槽盛裝緩沖液的體積，小膠 通常要在高壓下電泳（>10V/cm），所以選擇一個相對較大的緩沖液槽比較有利。
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3.核酸凝膠電泳實驗需要注意什么
大多情況下，加樣時不必更換槍頭，可在陰極槽中反復吸打電泳緩沖液清洗，但對Southern 印跡轉移和需回收DNA時，應每個樣品使用新的槍頭，以避免樣品交叉污染。
2、上樣緩沖液不僅提高樣品的密度，使樣品均勻沉到樣孔底，還使樣品帶色，便于上樣，估計電泳時間和判斷電泳位置。3、EB是一種強烈誘變劑并有中度毒性，應戴手套操作，對于含有EB的溶液也不應直接倒下水道，用后妥善凈化處理：EB含量大于0.5μg/ml溶 液先用水將EB濃度稀釋至0.5μg/ml以下，每100ml溶液加入100mg活性碳，不時輕輕搖蕩混勻，室溫放置1小時，濾紙過濾將活性碳與濾紙密封在塑料袋中作為有害廢物丟棄。
或用專用一次性染料清除袋（Gene有限公司）吸附過夜，再焚燒袋子即 可。4、應在暗箱窗口觀察結果，避免紫外線操作者的損傷。
5、電泳過程中，EB向陰極移動（與DNA相反），延長電泳時間，EB會從凝膠中遷移出來，從而使小片段DNA難于檢測，可將凝膠浸在 0.5μg/ml EB溶液中重新染色后檢測。6、加樣孔的加樣量依DNA樣品中片段的數(shù)量及大小而定，通常對0.5cm寬的加樣孔，DNA上樣量在0.1~0.5μg即可有良好的觀察效果。
如 樣品為酶切產物（由大小不同的DNA片段組成），每孔加20~30μg DNA也不致明顯影響分辨率。7、小的凝膠——微型凝膠和中型凝膠的電泳一般比大的凝膠要快，常常用于快速分析。
當選擇微型或中型凝膠裝置時要考慮凝膠槽盛裝緩沖液的體積，小膠 通常要在高壓下電泳（>10V/cm），所以選擇一個相對較大的緩沖液槽比較有利。……………………………………。
4.瓊脂糖凝膠電泳測dna實驗應注意哪些問題
凝膠電泳操作注意事項： 1. 緩沖系統(tǒng)：在沒有離子存在時，電導率最小，DNA不遷移，或遷移極慢，在高離子強度的緩沖液中，電導很高并產熱，可能導致DNA變性，因此應注意緩沖液的使用是否正確。
長時間高壓電泳時，常更新緩沖液或在兩槽間進行緩沖液的循環(huán)是可取的。 2. 瓊脂糖：不同廠家、不同批號的瓊脂糖，其雜質含量不同，影響DNA的遷移及熒光背景的強度，應有選擇地使用。
3. 凝膠的制備：凝膠中所加緩沖液應與電泳槽中的相一致，溶解的凝膠應及時倒入板中，避免倒入前凝固結塊。倒入板中的凝膠應避免出現(xiàn)氣泡，影響電泳結果。
瓊脂糖凝膠電泳注意事項及操作流程 凝膠電泳操作注意事項： 1. 緩沖系統(tǒng)：在沒有離子存在時，電導率最小，DNA不遷移，或遷移極慢，在高離子強度的緩沖液中，電導很高并產熱，可能導致DNA變性，因此應注意緩沖液的使用是否正確。長時間高壓電泳時，常更新緩沖液或在兩槽間進行緩沖液的循環(huán)是可取的。
2. 瓊脂糖：不同廠家、不同批號的瓊脂糖，其雜質含量不同，影響DNA的遷移及熒光背景的強度，應有選擇地使用。 3. 凝膠的制備：凝膠中所加緩沖液應與電泳槽中的相一致，溶解的凝膠應及時倒入板中，避免倒入前凝固結塊。
倒入板中的凝膠應避免出現(xiàn)氣泡，影響電泳結果。 4. 樣品加入量：一般情況下，0.5cm寬的梳子可加0.5ug的DNA量，加樣量的多少依據(jù)加樣孔的大小及DNA中片段的數(shù)量和大小而定，過多的量會造成加樣孔超載，從而導致拖尾和彌散，對于較大的DNA此現(xiàn)象更明顯。
5. 電泳系統(tǒng)的變化會影響DNA的遷移，加入DNA標準參照物進行判定是必要的。 6. DNA樣品中鹽濃度會影響DNA的遷移率，平行對照樣品應使用同樣的緩沖條件以消除這種影響。
7. DNA遷移率取決于瓊脂糖凝膠的濃度，遷移分子的形狀及大小。采用不同濃度的凝膠有可能分辨范圍廣泛的DNA分子，制備瓊脂糖凝膠可根據(jù)DNA分子的范圍來決定凝膠的濃度。
小片段的DNA電泳應采用聚丙烯酰胺凝膠電泳以提高分辨率。
5.核酸電泳的注意事項
1. 瓊脂糖：不同廠家、不同批號的瓊脂糖，其雜質含量不同，影響DNA的遷移及熒光背景的強度，應有選擇地使用。
2. 凝膠的制備：凝膠中所加緩沖液應與電泳槽中的相一致，溶解的凝膠應及時倒入板中，避免倒入前凝固結塊。倒入板中的凝膠應避免出現(xiàn)氣泡，以免影響電泳結果。
3. 電泳緩沖液：為保持電泳所需的離子強度和pH，應常更新電泳緩沖液。4. 樣品加入量：一般情況下，0.5cm寬的梳子可加0.5μg的DNA量，加樣量的多少依據(jù)加樣孔的大小及DNA中片段的數(shù)量和大小而定。
當加樣孔大時，樣品上樣量應相應加大，否則會造成條帶淺甚至辯認不清；反之則應適當減少加樣量，但是上樣量過多會造成加樣孔超載，從而導致拖尾和彌散，對于較大的DNA此現(xiàn)象更明顯。5. DNA樣品中鹽濃度會影響DNA的遷移率，平行對照樣品應使用同樣的緩沖條件以消除這種影響。
DNA遷移率取決于瓊脂糖凝膠的濃度，遷移分子的形狀及大小。采用不同濃度的凝膠有可能分辨范圍廣泛的DNA分子，制備瓊脂糖凝膠可根據(jù)DNA分子的范圍來決定凝膠的濃度。
小片段的DNA電泳應采用聚丙烯酰胺凝膠電泳以提高分辨率?；厥章实突驗榱?1. 漂洗緩沖液中沒加入乙醇.在使用前應確保乙醇已加入漂洗液PW中。
2. 吸附材料上有乙醇殘留.洗脫時硅膠膜或硅膠樹脂上有漂洗緩沖液殘留，因含乙醇會降低洗脫效率。在洗脫前可通過再次離心或置于50℃烤箱中5-10分鐘，徹底去除漂洗緩沖液。
3. 洗脫緩沖液pH值偏低.DNA只在低鹽buffer中才能被洗脫，如洗脫緩沖液EB (10 mM Tris·Cl, pH 8.5)或水。洗脫效率取決于pH值。
最大洗脫效率在pH7.0-8.5間。當用水洗脫時確保其pH值在此范圍內。
4. 洗脫液加入位置不正確.洗脫液應加在硅膠膜中心部位以確保洗脫液會完全覆蓋硅膠膜的表面，達到最大洗脫效率。DNA質量不好 洗脫產物含有乙醇殘留.洗脫時硅膠膜或硅膠樹脂上有漂洗緩沖液殘留，會使洗脫產物中含有乙醇，影響下游操作。
在洗脫前可通過再次離心或置于50℃烤箱中5-10分鐘，徹底去除漂洗緩沖液。
