色譜題庫(kù)(介紹高效液相色譜法入門(mén)知識(shí))
1.介紹高效液相色譜法入門(mén)知識(shí)
樓主，您好。
高效液相色譜法系采用高壓輸液泵將規(guī)定的流動(dòng)相泵入裝有填充劑的色譜柱進(jìn)行分離測(cè)定的色譜方法。注入進(jìn)樣閥的供試品，由流動(dòng)相帶入柱內(nèi)，各成分在柱內(nèi)被分離，并依次進(jìn)入檢測(cè)器，由記錄儀、積分儀或數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)記錄色譜信號(hào)。
采用微柱液相色譜系統(tǒng)可以減少溶劑的消耗并達(dá)到快速分離之目的。 高效液相色譜法的主要分離機(jī)制有吸附、分配、離子交換和排阻作用。
1.對(duì)儀器的一般要求 所用的儀器為高效液相色譜儀。儀器應(yīng)定期檢定并符合有關(guān)規(guī)定。
（1）色譜柱 最常用的色譜柱填充劑為化學(xué)鍵合硅膠。反相色譜系統(tǒng)使用非極性填充劑，以十八烷基硅烷鍵合硅膠最為常用，辛基硅烷鍵合硅膠和其他類型的硅烷鍵合硅膠（如氰基硅烷鍵合相和氨基硅烷鍵合相等）也有使用。
正相色譜系統(tǒng)使用極性填充劑，常用的填充劑有硅膠等。離子交換填充劑用于離子交換色譜；凝膠或高分子微球等填充劑用于分子排阻色譜等；手性鍵合填充劑用于對(duì)映異構(gòu)體的拆分分析。
填充劑的性能（如載體的形狀、粒徑、孔徑、表面積、鍵合基團(tuán)的表面覆蓋度、含碳量和鍵合類型等因素）以及色譜柱的填充，將直接影響待測(cè)物的保留行為和分離效果?？讖皆?50？以下的填料適合于分析分子量小于2000的化合物，分子量大于2000的化合物則應(yīng)選擇孔徑在300？以上的填料。
以硅膠為載體的鍵合固定相填充劑適用pH2~8的流動(dòng)相。當(dāng)pH大于8時(shí)，可使載體硅膠溶解；當(dāng)pH小于2時(shí)，與硅膠相連的化學(xué)鍵合相易水解脫落。
當(dāng)色譜系統(tǒng)中需使用pH大于8的流動(dòng)相時(shí)，應(yīng)選用耐堿的填充劑，如采用高純硅膠為載體并具有高表面覆蓋度的鍵合硅膠、包覆聚合物填充劑、有機(jī)-無(wú)機(jī)雜化填充劑或非硅膠填充劑等；當(dāng)需使用pH小于2的流動(dòng)相時(shí)，應(yīng)選用耐酸的填充劑，如具有大體積側(cè)鏈能產(chǎn)生空間位阻保護(hù)作用的二異丙基或二異丁基取代十八烷基硅烷鍵合硅膠、有機(jī)-無(wú)機(jī)雜化填充劑等。 （2）檢測(cè)器 最常用的檢測(cè)器為紫外吸收檢測(cè)器，其他常見(jiàn)的檢測(cè)器有二極管陣列檢測(cè)器（DAD）、熒光檢測(cè)器、示差折光檢測(cè)器、蒸發(fā)光散射檢測(cè)器、電化學(xué)檢測(cè)器和質(zhì)譜檢測(cè)器等。
紫外、二極管陣列、熒光、電化學(xué)檢測(cè)器為選擇性檢測(cè)器，其響應(yīng)值不僅與待測(cè)物的質(zhì)量有關(guān)，還與化合物的結(jié)構(gòu)有關(guān)；示差折光檢測(cè)器和蒸發(fā)光散射檢測(cè)器為通用型檢測(cè)器，對(duì)所有的化合物結(jié)構(gòu)均有響應(yīng)；蒸發(fā)光散射檢測(cè)器屬質(zhì)量型檢測(cè)器，對(duì)結(jié)構(gòu)類似的化合物，其響應(yīng)值幾乎僅與待測(cè)物的質(zhì)量有關(guān)；二極管陣列檢測(cè)器可以同時(shí)記錄待測(cè)物在規(guī)定波長(zhǎng)范圍內(nèi)的吸收光譜，故可用于待測(cè)物的光譜管制和色譜峰純度的檢查。紫外、熒光、電化學(xué)和示差折光檢測(cè)器的響應(yīng)值與待測(cè)物的質(zhì)量呈線性關(guān)系，但蒸發(fā)光散射檢測(cè)器響應(yīng)值與待測(cè)物的質(zhì)量通常并不呈線性關(guān)系，必要時(shí)需對(duì)響應(yīng)值進(jìn)行數(shù)學(xué)轉(zhuǎn)換后進(jìn)行計(jì)算。
不同的檢測(cè)器，對(duì)流動(dòng)相的要求不同。當(dāng)采用紫外檢測(cè)器時(shí)，所用流動(dòng)相應(yīng)至少符合紫外分光光度法（附錄ⅣA）項(xiàng)下對(duì)溶劑的要求；采用低波長(zhǎng)檢測(cè)時(shí)，還應(yīng)考慮有機(jī)相中有機(jī)溶劑的截止使用波長(zhǎng)，并選用色譜級(jí)有機(jī)溶劑。
蒸發(fā)光散射檢測(cè)器和質(zhì)譜檢測(cè)器通常不允許使用含不揮發(fā)鹽組分的流動(dòng)相。 （3）流動(dòng)相 由于C18鏈在水相環(huán)境中不易保持伸展?fàn)顟B(tài)，故對(duì)于十八烷基硅烷鍵合硅膠為固定相的反相色譜系統(tǒng)，流動(dòng)相中有機(jī)溶劑的比例通常不應(yīng)低于5%，否則C18鏈的隨機(jī)卷曲將導(dǎo)致組分保留值變化，造成色譜系統(tǒng)不穩(wěn)定。
正文中各品種項(xiàng)下規(guī)定的條件除固定相種類、流動(dòng)相組成、檢測(cè)器類型不得任意改變外，其余如色譜柱內(nèi)徑、長(zhǎng)度、固定相牌號(hào)、載體粒度、流動(dòng)相流速、混合流動(dòng)相各組成的比例、柱溫、進(jìn)樣量、檢測(cè)器的靈敏度等，均可適當(dāng)改變，以適應(yīng)具體的色譜系統(tǒng)并達(dá)到系統(tǒng)適用性試驗(yàn)的要求。但對(duì)某些品種，必須用特定牌號(hào)的填充劑方能滿足分離要求，可在該品種項(xiàng)下注明。
2.系統(tǒng)適用性試驗(yàn) 色譜中最難分離物質(zhì)對(duì)或與其相關(guān)的物質(zhì)對(duì)的分離度和待測(cè)物響應(yīng)值的重復(fù)性是系統(tǒng)適用性試驗(yàn)的重要參數(shù)。 按各品種項(xiàng)下要求對(duì)色譜系統(tǒng)進(jìn)行適用性試驗(yàn)，即用規(guī)定的對(duì)照品對(duì)色譜系統(tǒng)進(jìn)行試驗(yàn)和調(diào)整，應(yīng)符合要求；或規(guī)定色譜條件下的最小理論板數(shù)、分離度、重復(fù)性和拖尾因子。
（1）色譜柱的理論板數(shù)（n） 在規(guī)定的色譜的條件下，注入供試品溶液或各品種項(xiàng)下規(guī)定的內(nèi)標(biāo)物質(zhì)溶液，記錄色譜圖，量出供試品主成分或內(nèi)標(biāo)物質(zhì)峰的保留時(shí)間tR（以分鐘或長(zhǎng)度計(jì)，下同，但應(yīng)取相同單位）和半高峰寬（Wh/2），按n=5.54(tR/Wh/2)2計(jì)算色譜柱的理論板數(shù)，如果測(cè)得理論板數(shù)低于各品種項(xiàng)下規(guī)定的最小理論板數(shù)，應(yīng)改變色譜柱的某些條件（如柱長(zhǎng)、載體性能、色譜柱充填的效果等），使理論板數(shù)符合要求。 （2）分離度定量分析時(shí)，為便于準(zhǔn)確測(cè)量，要求定量峰與其他峰或內(nèi)標(biāo)峰之間有較好的分離度。
分離度（R）的計(jì)算公式為： 式中tR2為相鄰兩峰中后一峰的保留時(shí)間； tR1為相鄰兩峰中前一峰的保留時(shí)間； W1及W2為此相鄰兩峰的峰寬。 除另有規(guī)定外，分離度應(yīng)大于1.5。
(3)重復(fù)性 取各品種項(xiàng)下的對(duì)照溶液，連續(xù)進(jìn)樣3~5次，除另有規(guī)定外，其峰面積測(cè)量值的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差應(yīng)不大于2.0%。也可按各品種校正因子測(cè)定項(xiàng)。
2.氣相色譜的專業(yè)知識(shí)
1 氣相色譜 氣相色譜是一種以氣體為流動(dòng)相的柱色譜法，根據(jù)所用固定相狀態(tài)的不同可分為氣-固色譜（GSC）和氣-液色譜（GLC）。
2 氣相色譜原理 氣相色譜的流動(dòng)相為惰性氣體，氣-固色譜法中以表面積大且具有一定活性的吸附劑作為固定相。當(dāng)多組分的混合樣品進(jìn)入色譜柱后，由于吸附劑對(duì)每個(gè)組分的吸附力不同，經(jīng)過(guò)一定時(shí)間后，各組分在色譜柱中的運(yùn)行速度也就不同。
吸附力弱的組分容易被解吸下來(lái)，最先離開(kāi)色譜柱進(jìn)入檢測(cè)器，而吸附力最強(qiáng)的組分最不容易被解吸下來(lái)，因此最后離開(kāi)色譜柱。如此，各組分得以在色譜柱中彼此分離，順序進(jìn)入檢測(cè)器中被檢測(cè)、記錄下來(lái)。
3 氣相色譜流程 載氣由高壓鋼瓶中流出，經(jīng)減壓閥降壓到所需壓力后，通過(guò)凈化干燥管使載氣凈化，再經(jīng)穩(wěn)壓閥和轉(zhuǎn)子流量計(jì)后，以穩(wěn)定的壓力、恒定的速度流經(jīng)氣化室與氣化的樣品混合，將樣品氣體帶入色譜柱中進(jìn)行分離。分離后的各組分隨著載氣先后流入檢測(cè)器，然后載氣放空。
檢測(cè)器將物質(zhì)的濃度或質(zhì)量的變化轉(zhuǎn)變?yōu)橐欢ǖ碾娦盘?hào)，經(jīng)放大后在記錄儀上記錄下來(lái)，就得到色譜流出曲線。根據(jù)色譜流出曲線上得到的每個(gè)峰的保留時(shí)間，可以進(jìn)行定性分析，根據(jù)峰面積或峰高的大小，可以進(jìn)行定量分析。
4 氣相色譜儀 由以下五大系統(tǒng)組成：氣路系統(tǒng)、進(jìn)樣系統(tǒng)、分離系統(tǒng)、溫控系統(tǒng)、檢測(cè)記錄系統(tǒng)。組分能否分開(kāi)，關(guān)鍵在于色譜柱；分離后組分能否鑒定出來(lái)則在于檢測(cè)器，所以分離系統(tǒng)和檢測(cè)系統(tǒng)是儀器的核心。
5 氣相色譜儀幾種常用檢測(cè)器 目前有很多種檢測(cè)器，其中常用的檢測(cè)器是：氫火焰離子化檢測(cè)器（FID） 熱導(dǎo)檢測(cè)器（TCD） 氮磷檢測(cè)器 （NPD）火焰光度檢測(cè)器（FPD） 電子捕獲檢測(cè)器（ECD）等類型。氫火焰離子化檢測(cè)器（FID）：（氫）火焰離子化檢測(cè)器是根據(jù)氣體的導(dǎo)電率是與該氣體中所含帶電離子的濃度呈正比這一事實(shí)而設(shè)計(jì)的。
一般情況下，組分蒸汽不導(dǎo)電，但在能源作用下，組分蒸汽可被電離生成帶電離子而導(dǎo)電。工作原理：由色譜柱流出的載氣（樣品）流經(jīng)溫度高達(dá)2100℃的氫火焰時(shí)，待測(cè)有機(jī)物組分在火焰中發(fā)生離子化作用，使兩個(gè)電極之間出現(xiàn)一定量的正、負(fù)離子，在電場(chǎng)的作用下，正、負(fù)離子各被相應(yīng)電極所收集。
當(dāng)載氣中不含待測(cè)物時(shí)，火焰中離子很少，即基流很小，約10-14A。當(dāng)待測(cè)有機(jī)物通過(guò)檢測(cè)器時(shí)，火焰中電離的離子增多，電流增大（但很微弱10-8~10-12A）。
需經(jīng)高電阻（108~l011）后得到較大的電壓信號(hào)，再由放大器放大，才能在記錄儀上顯示出足夠大的色譜峰。該電流的大小，在一定范圍內(nèi)與單位時(shí)間內(nèi)進(jìn)入檢測(cè)器的待測(cè)組分的質(zhì)量成正比，所以火焰離子化檢測(cè)器是質(zhì)量型檢測(cè)器。
火焰離子化檢測(cè)器對(duì)電離勢(shì)低于H2的有機(jī)物產(chǎn)生響應(yīng)，而對(duì)無(wú)機(jī)物、久性氣體和水基本上無(wú)響應(yīng)，所以火焰離子化檢測(cè)器只能分析有機(jī)物（含碳化合物），不適于分析惰性氣體、空氣、水、CO、CO2、CS2、NO、SO2及H2S等。熱導(dǎo)檢測(cè)器（TCD）：熱導(dǎo)檢測(cè)器（TCD）又稱熱導(dǎo)池或熱絲檢熱器，是氣相色譜法最常用的一種檢測(cè)器。
基于不同組分與載氣有不同的熱導(dǎo)率的原理而工作的熱傳導(dǎo)檢測(cè)器。工作原理：熱導(dǎo)檢測(cè)器的工作原理是基于不同氣體具有不同的熱導(dǎo)率。
熱絲具有電阻隨溫度變化的特性。當(dāng)有一恒定直流電通過(guò)熱導(dǎo)池時(shí)，熱絲被加熱。
由于載氣的熱傳導(dǎo)作用使熱絲的一部分熱量被載氣帶走，一部分傳給池體。當(dāng)熱絲產(chǎn)生的熱量與散失熱量達(dá)到平衡時(shí)，熱絲溫度就穩(wěn)定在一定數(shù)值。
此時(shí)，熱絲阻值也穩(wěn)定在一定數(shù)值。由于參比池和測(cè)量池通入的都是純載氣，同一種載氣有相同的熱導(dǎo)率，因此兩臂的電阻值相同，電橋平衡，無(wú)信號(hào)輸出，記錄系統(tǒng)記錄的是一條直線。
當(dāng)有試樣進(jìn)入檢測(cè)器時(shí)，純載氣流經(jīng)參比池，載氣攜帶著組分氣流經(jīng)測(cè)量池，由于載氣和待測(cè)量組分二元混合氣體的熱導(dǎo)率和純載氣的熱導(dǎo)率不同，測(cè)量池中散熱情況因而發(fā)生變化，使參比池和測(cè)量池孔中熱絲電阻值之間產(chǎn)生了差異，電橋失去平衡，檢測(cè)器有電壓信號(hào)輸出，記錄儀畫(huà)出相應(yīng)組分的色譜峰。載氣中待測(cè)組分的濃度越大，測(cè)量池中氣體熱導(dǎo)率改變就越顯著，溫度和電阻值改變也越顯著，電壓信號(hào)就越強(qiáng)。
此時(shí)輸出的電壓信號(hào)與樣品的濃度成正比，這正是熱導(dǎo)檢測(cè)器的定量基礎(chǔ)。熱導(dǎo)池（TCD）檢測(cè)器是一種通用的非破壞性濃度型檢測(cè)器，一直是實(shí)際工作中應(yīng)用最多的氣相色譜檢測(cè)器之一。
TCD特別適用于氣體混合物的分析，對(duì)于那些氫火焰離子化檢測(cè)器不能直接檢測(cè)的無(wú)機(jī)氣體的分析，TCD更是顯示出獨(dú)到之處。TCD在檢測(cè)過(guò)程中不破壞被監(jiān)測(cè)組份，有利于樣品的收集，或與其他儀器聯(lián)用。
TCD能滿足工業(yè)分析中峰高定量的要求，很適于工廠的控制分析。氮磷檢測(cè)器 （NPD）：氮磷檢測(cè)器（NPD）是一種質(zhì)量檢測(cè)器，適用于分析氮，磷化合物的高靈敏度、高選擇性檢測(cè)器。
它具有與FID相似的結(jié)構(gòu)，只是將一種涂有堿金屬鹽如Na2SiO3,Rb2SiO3類化合物的陶瓷珠，放置在燃燒的氫火焰和收集極之間，當(dāng)試樣蒸氣和氫氣流通過(guò)堿金屬鹽表面時(shí)，含氮、磷的化合物便會(huì)從被還原的堿金屬蒸氣上獲得電子，失去電子的堿金屬形成鹽再沉積到陶瓷珠的表面上。工作。
