色譜題庫(介紹高效液相色譜法入門知識)

1.介紹高效液相色譜法入門知識

樓主，您好。

高效液相色譜法系采用高壓輸液泵將規(guī)定的流動相泵入裝有填充劑的色譜柱進行分離測定的色譜方法。注入進樣閥的供試品，由流動相帶入柱內(nèi)，各成分在柱內(nèi)被分離，并依次進入檢測器，由記錄儀、積分儀或數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)記錄色譜信號。

采用微柱液相色譜系統(tǒng)可以減少溶劑的消耗并達到快速分離之目的。 高效液相色譜法的主要分離機制有吸附、分配、離子交換和排阻作用。

1.對儀器的一般要求 所用的儀器為高效液相色譜儀。儀器應(yīng)定期檢定并符合有關(guān)規(guī)定。

（1）色譜柱 最常用的色譜柱填充劑為化學(xué)鍵合硅膠。反相色譜系統(tǒng)使用非極性填充劑，以十八烷基硅烷鍵合硅膠最為常用，辛基硅烷鍵合硅膠和其他類型的硅烷鍵合硅膠（如氰基硅烷鍵合相和氨基硅烷鍵合相等）也有使用。

正相色譜系統(tǒng)使用極性填充劑，常用的填充劑有硅膠等。離子交換填充劑用于離子交換色譜；凝膠或高分子微球等填充劑用于分子排阻色譜等；手性鍵合填充劑用于對映異構(gòu)體的拆分分析。

填充劑的性能（如載體的形狀、粒徑、孔徑、表面積、鍵合基團的表面覆蓋度、含碳量和鍵合類型等因素）以及色譜柱的填充，將直接影響待測物的保留行為和分離效果?？讖皆?50？以下的填料適合于分析分子量小于2000的化合物，分子量大于2000的化合物則應(yīng)選擇孔徑在300？以上的填料。

以硅膠為載體的鍵合固定相填充劑適用pH2~8的流動相。當pH大于8時，可使載體硅膠溶解；當pH小于2時，與硅膠相連的化學(xué)鍵合相易水解脫落。

當色譜系統(tǒng)中需使用pH大于8的流動相時，應(yīng)選用耐堿的填充劑，如采用高純硅膠為載體并具有高表面覆蓋度的鍵合硅膠、包覆聚合物填充劑、有機-無機雜化填充劑或非硅膠填充劑等；當需使用pH小于2的流動相時，應(yīng)選用耐酸的填充劑，如具有大體積側(cè)鏈能產(chǎn)生空間位阻保護作用的二異丙基或二異丁基取代十八烷基硅烷鍵合硅膠、有機-無機雜化填充劑等。 （2）檢測器 最常用的檢測器為紫外吸收檢測器，其他常見的檢測器有二極管陣列檢測器（DAD）、熒光檢測器、示差折光檢測器、蒸發(fā)光散射檢測器、電化學(xué)檢測器和質(zhì)譜檢測器等。

紫外、二極管陣列、熒光、電化學(xué)檢測器為選擇性檢測器，其響應(yīng)值不僅與待測物的質(zhì)量有關(guān)，還與化合物的結(jié)構(gòu)有關(guān)；示差折光檢測器和蒸發(fā)光散射檢測器為通用型檢測器，對所有的化合物結(jié)構(gòu)均有響應(yīng)；蒸發(fā)光散射檢測器屬質(zhì)量型檢測器，對結(jié)構(gòu)類似的化合物，其響應(yīng)值幾乎僅與待測物的質(zhì)量有關(guān)；二極管陣列檢測器可以同時記錄待測物在規(guī)定波長范圍內(nèi)的吸收光譜，故可用于待測物的光譜管制和色譜峰純度的檢查。紫外、熒光、電化學(xué)和示差折光檢測器的響應(yīng)值與待測物的質(zhì)量呈線性關(guān)系，但蒸發(fā)光散射檢測器響應(yīng)值與待測物的質(zhì)量通常并不呈線性關(guān)系，必要時需對響應(yīng)值進行數(shù)學(xué)轉(zhuǎn)換后進行計算。

不同的檢測器，對流動相的要求不同。當采用紫外檢測器時，所用流動相應(yīng)至少符合紫外分光光度法（附錄ⅣA）項下對溶劑的要求；采用低波長檢測時，還應(yīng)考慮有機相中有機溶劑的截止使用波長，并選用色譜級有機溶劑。

蒸發(fā)光散射檢測器和質(zhì)譜檢測器通常不允許使用含不揮發(fā)鹽組分的流動相。 （3）流動相 由于C18鏈在水相環(huán)境中不易保持伸展狀態(tài)，故對于十八烷基硅烷鍵合硅膠為固定相的反相色譜系統(tǒng)，流動相中有機溶劑的比例通常不應(yīng)低于5%，否則C18鏈的隨機卷曲將導(dǎo)致組分保留值變化，造成色譜系統(tǒng)不穩(wěn)定。

正文中各品種項下規(guī)定的條件除固定相種類、流動相組成、檢測器類型不得任意改變外，其余如色譜柱內(nèi)徑、長度、固定相牌號、載體粒度、流動相流速、混合流動相各組成的比例、柱溫、進樣量、檢測器的靈敏度等，均可適當改變，以適應(yīng)具體的色譜系統(tǒng)并達到系統(tǒng)適用性試驗的要求。但對某些品種，必須用特定牌號的填充劑方能滿足分離要求，可在該品種項下注明。

2.系統(tǒng)適用性試驗 色譜中最難分離物質(zhì)對或與其相關(guān)的物質(zhì)對的分離度和待測物響應(yīng)值的重復(fù)性是系統(tǒng)適用性試驗的重要參數(shù)。 按各品種項下要求對色譜系統(tǒng)進行適用性試驗，即用規(guī)定的對照品對色譜系統(tǒng)進行試驗和調(diào)整，應(yīng)符合要求；或規(guī)定色譜條件下的最小理論板數(shù)、分離度、重復(fù)性和拖尾因子。

（1）色譜柱的理論板數(shù)（n） 在規(guī)定的色譜的條件下，注入供試品溶液或各品種項下規(guī)定的內(nèi)標物質(zhì)溶液，記錄色譜圖，量出供試品主成分或內(nèi)標物質(zhì)峰的保留時間tR（以分鐘或長度計，下同，但應(yīng)取相同單位）和半高峰寬（Wh/2），按n=5.54(tR/Wh/2)2計算色譜柱的理論板數(shù)，如果測得理論板數(shù)低于各品種項下規(guī)定的最小理論板數(shù)，應(yīng)改變色譜柱的某些條件（如柱長、載體性能、色譜柱充填的效果等），使理論板數(shù)符合要求。 （2）分離度定量分析時，為便于準確測量，要求定量峰與其他峰或內(nèi)標峰之間有較好的分離度。

分離度（R）的計算公式為： 式中tR2為相鄰兩峰中后一峰的保留時間； tR1為相鄰兩峰中前一峰的保留時間； W1及W2為此相鄰兩峰的峰寬。 除另有規(guī)定外，分離度應(yīng)大于1.5。

(3)重復(fù)性 取各品種項下的對照溶液，連續(xù)進樣3~5次，除另有規(guī)定外，其峰面積測量值的相對標準偏差應(yīng)不大于2.0%。也可按各品種校正因子測定項。

2.氣相色譜的專業(yè)知識

1 氣相色譜 氣相色譜是一種以氣體為流動相的柱色譜法，根據(jù)所用固定相狀態(tài)的不同可分為氣-固色譜（GSC）和氣-液色譜（GLC）。

2 氣相色譜原理 氣相色譜的流動相為惰性氣體，氣-固色譜法中以表面積大且具有一定活性的吸附劑作為固定相。當多組分的混合樣品進入色譜柱后，由于吸附劑對每個組分的吸附力不同，經(jīng)過一定時間后，各組分在色譜柱中的運行速度也就不同。

吸附力弱的組分容易被解吸下來，最先離開色譜柱進入檢測器，而吸附力最強的組分最不容易被解吸下來，因此最后離開色譜柱。如此，各組分得以在色譜柱中彼此分離，順序進入檢測器中被檢測、記錄下來。

3 氣相色譜流程 載氣由高壓鋼瓶中流出，經(jīng)減壓閥降壓到所需壓力后，通過凈化干燥管使載氣凈化，再經(jīng)穩(wěn)壓閥和轉(zhuǎn)子流量計后，以穩(wěn)定的壓力、恒定的速度流經(jīng)氣化室與氣化的樣品混合，將樣品氣體帶入色譜柱中進行分離。分離后的各組分隨著載氣先后流入檢測器，然后載氣放空。

檢測器將物質(zhì)的濃度或質(zhì)量的變化轉(zhuǎn)變?yōu)橐欢ǖ碾娦盘?，?jīng)放大后在記錄儀上記錄下來，就得到色譜流出曲線。根據(jù)色譜流出曲線上得到的每個峰的保留時間，可以進行定性分析，根據(jù)峰面積或峰高的大小，可以進行定量分析。

4 氣相色譜儀 由以下五大系統(tǒng)組成：氣路系統(tǒng)、進樣系統(tǒng)、分離系統(tǒng)、溫控系統(tǒng)、檢測記錄系統(tǒng)。組分能否分開，關(guān)鍵在于色譜柱；分離后組分能否鑒定出來則在于檢測器，所以分離系統(tǒng)和檢測系統(tǒng)是儀器的核心。

5 氣相色譜儀幾種常用檢測器 目前有很多種檢測器，其中常用的檢測器是：氫火焰離子化檢測器（FID） 熱導(dǎo)檢測器（TCD） 氮磷檢測器 （NPD）火焰光度檢測器（FPD） 電子捕獲檢測器（ECD）等類型。氫火焰離子化檢測器（FID）：（氫）火焰離子化檢測器是根據(jù)氣體的導(dǎo)電率是與該氣體中所含帶電離子的濃度呈正比這一事實而設(shè)計的。

一般情況下，組分蒸汽不導(dǎo)電，但在能源作用下，組分蒸汽可被電離生成帶電離子而導(dǎo)電。工作原理：由色譜柱流出的載氣（樣品）流經(jīng)溫度高達2100℃的氫火焰時，待測有機物組分在火焰中發(fā)生離子化作用，使兩個電極之間出現(xiàn)一定量的正、負離子，在電場的作用下，正、負離子各被相應(yīng)電極所收集。

當載氣中不含待測物時，火焰中離子很少，即基流很小，約10-14A。當待測有機物通過檢測器時，火焰中電離的離子增多，電流增大（但很微弱10-8~10-12A）。

需經(jīng)高電阻（108~l011）后得到較大的電壓信號，再由放大器放大，才能在記錄儀上顯示出足夠大的色譜峰。該電流的大小，在一定范圍內(nèi)與單位時間內(nèi)進入檢測器的待測組分的質(zhì)量成正比，所以火焰離子化檢測器是質(zhì)量型檢測器。

火焰離子化檢測器對電離勢低于H2的有機物產(chǎn)生響應(yīng)，而對無機物、久性氣體和水基本上無響應(yīng)，所以火焰離子化檢測器只能分析有機物（含碳化合物），不適于分析惰性氣體、空氣、水、CO、CO2、CS2、NO、SO2及H2S等。熱導(dǎo)檢測器（TCD）：熱導(dǎo)檢測器（TCD）又稱熱導(dǎo)池或熱絲檢熱器，是氣相色譜法最常用的一種檢測器。

基于不同組分與載氣有不同的熱導(dǎo)率的原理而工作的熱傳導(dǎo)檢測器。工作原理：熱導(dǎo)檢測器的工作原理是基于不同氣體具有不同的熱導(dǎo)率。

熱絲具有電阻隨溫度變化的特性。當有一恒定直流電通過熱導(dǎo)池時，熱絲被加熱。

由于載氣的熱傳導(dǎo)作用使熱絲的一部分熱量被載氣帶走，一部分傳給池體。當熱絲產(chǎn)生的熱量與散失熱量達到平衡時，熱絲溫度就穩(wěn)定在一定數(shù)值。

此時，熱絲阻值也穩(wěn)定在一定數(shù)值。由于參比池和測量池通入的都是純載氣，同一種載氣有相同的熱導(dǎo)率，因此兩臂的電阻值相同，電橋平衡，無信號輸出，記錄系統(tǒng)記錄的是一條直線。

當有試樣進入檢測器時，純載氣流經(jīng)參比池，載氣攜帶著組分氣流經(jīng)測量池，由于載氣和待測量組分二元混合氣體的熱導(dǎo)率和純載氣的熱導(dǎo)率不同，測量池中散熱情況因而發(fā)生變化，使參比池和測量池孔中熱絲電阻值之間產(chǎn)生了差異，電橋失去平衡，檢測器有電壓信號輸出，記錄儀畫出相應(yīng)組分的色譜峰。載氣中待測組分的濃度越大，測量池中氣體熱導(dǎo)率改變就越顯著，溫度和電阻值改變也越顯著，電壓信號就越強。

此時輸出的電壓信號與樣品的濃度成正比，這正是熱導(dǎo)檢測器的定量基礎(chǔ)。熱導(dǎo)池（TCD）檢測器是一種通用的非破壞性濃度型檢測器，一直是實際工作中應(yīng)用最多的氣相色譜檢測器之一。

TCD特別適用于氣體混合物的分析，對于那些氫火焰離子化檢測器不能直接檢測的無機氣體的分析，TCD更是顯示出獨到之處。TCD在檢測過程中不破壞被監(jiān)測組份，有利于樣品的收集，或與其他儀器聯(lián)用。

TCD能滿足工業(yè)分析中峰高定量的要求，很適于工廠的控制分析。氮磷檢測器 （NPD）：氮磷檢測器（NPD）是一種質(zhì)量檢測器，適用于分析氮，磷化合物的高靈敏度、高選擇性檢測器。

它具有與FID相似的結(jié)構(gòu)，只是將一種涂有堿金屬鹽如Na2SiO3,Rb2SiO3類化合物的陶瓷珠，放置在燃燒的氫火焰和收集極之間，當試樣蒸氣和氫氣流通過堿金屬鹽表面時，含氮、磷的化合物便會從被還原的堿金屬蒸氣上獲得電子，失去電子的堿金屬形成鹽再沉積到陶瓷珠的表面上。工作。