藥物純度檢測(cè)方法(求助：檢測(cè)純度的方法)

1.求助：檢測(cè)純度的方法

紫外吸收檢測(cè)DNA濃度與純度2007年11月13日 星期二 11:40目的： 了解紫外吸收檢測(cè)DNA濃度與純度的原理，掌握測(cè)定方法。

原理： 核酸的最大吸收波長(zhǎng)為260nm，蛋白質(zhì)為280nm，在波長(zhǎng)260nm時(shí)，1OD值相當(dāng)于雙鏈DNA濃度為50μg/ml，單鏈 寡核苷酸的含量為30μg/ml，可以據(jù)此來(lái)計(jì)算核酸樣品的濃度，還可通過(guò)測(cè)定在260nm和280nm的OD值的比值 （OD260/OD280），估計(jì)核酸的純度。純凈DNA的比值為1.8, RNA為2.0。

若比值高于1.8說(shuō)明DNA樣品中的RNA尚未除 盡，若樣品中含有酚和蛋白質(zhì)將導(dǎo)致比值降低。270nm存在高吸收表明有酚的干擾。

紫外分光光度法只能用于測(cè)定濃度 大于0.25μg/ml的核酸溶液，對(duì)濃度更小的樣品，可采用熒光分光光度法。 試劑與儀器： 提取的質(zhì)粒DNA，紫外分光光度儀。

操作步驟： 1） 分光光度計(jì)先用水在260nm和280nm兩個(gè)波長(zhǎng)下校零。 2） 取質(zhì)粒DNA樣品2μl，用水稀釋100倍，轉(zhuǎn)入分光光度計(jì)的石英比色杯中。

3） 在260nm和280nm分別讀出樣品光密度值。如果樣品濃度單位為μg/μl，則樣品DNA濃度為OD 值的10倍，即如 OD260=0.1，則樣品濃度即為1μg/μl。

4） 若OD260/OD280大于1.8，說(shuō)明仍有RNA，可以考慮用RNA酶處理樣品，若小于1.8，說(shuō) 明樣品中含有蛋白質(zhì)或酚，應(yīng)再用酚/氯仿抽提，以乙醇沉淀純化DNA。

2.藥物中測(cè)定某物質(zhì)含量的常用方法有那些

方法的驗(yàn)證： 訂入質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的含量測(cè)定法不同于一般質(zhì)量考察的方法，須經(jīng)過(guò)嚴(yán)格的方法學(xué)驗(yàn)證，不同原理的測(cè)定法具有不同的驗(yàn)證內(nèi)容及要求：

(1)容量分析法的驗(yàn)證：①精密度：用原料藥精制品考察方法精密度，平行試驗(yàn)5個(gè)樣本的RSD≤0.2%；②準(zhǔn)確度：以測(cè)定原料精制品（含量>99.5%）的回收率（測(cè)定值與理論值的比值）計(jì)算，應(yīng)在99.7%~100.3%之間（n=5,RSD≤0.1%）；③滴定終點(diǎn)確定的依據(jù)：包括滴定曲線的繪制，如用指示劑法確定終點(diǎn)，應(yīng)用電位法校準(zhǔn)終點(diǎn)顏色，提供指示劑顏色與電位變化情況的對(duì)比結(jié)果；④耐用性：考察測(cè)定條件（供試液穩(wěn)定性、樣品提取次數(shù)、時(shí)間等）有微小變動(dòng)時(shí)，測(cè)定結(jié)果不受影響的承受程度，如測(cè)試條件要求苛刻時(shí)則應(yīng)在方法中注明。

(2)HPLC法的驗(yàn)證：①精密度：RSD≤2%(n=5)；②準(zhǔn)確度：用于制劑時(shí)，要考察輔料的影響，將一定量藥物加到按處方比例配制的輔料中（為標(biāo)示量的80%~120%）制成高、中、低三個(gè)劑量，混合均勻后，每個(gè)劑量取三份樣品，按擬定方法測(cè)定回收率，應(yīng)在98%~102%之間（n=9, RSD≤2%）。③線性范圍：用已知含量的精制品配制一系列濃度的溶液（n=5~7），用濃度C對(duì)峰面積A或峰高h(yuǎn)或被測(cè)物的響應(yīng)值之比進(jìn)行回歸處理，線性方程的相關(guān)系數(shù)r≥0.999，截距應(yīng)趨于零，并提供線性關(guān)系圖；④專屬性：輔料、有關(guān)物質(zhì)或降解產(chǎn)物峰對(duì)主藥峰應(yīng)無(wú)干擾；⑤耐用性：考察測(cè)定條件（供試液穩(wěn)定性、流動(dòng)相組成和pH值、不同品牌或批號(hào)的同類色譜柱、柱溫、流速、樣品提取次數(shù)、時(shí)間等）有微小變動(dòng)時(shí)，測(cè)定結(jié)果不受影響的承受程度，如測(cè)試條件要求苛刻時(shí)則應(yīng)在方法中注明；⑥靈敏度：作為常量分析法，此項(xiàng)可不作主要要求。

(3)UV法的驗(yàn)證：①精密度：RSD≤1%(n=5)；②準(zhǔn)確度：方法同HPLC法，回收率應(yīng)在98%~102%之間（n=9, RSD≤2%），同時(shí)要求輔料、有關(guān)物質(zhì)或降解產(chǎn)物在測(cè)定波長(zhǎng)處無(wú)吸收。③線性范圍：用已知含量的精制品配制一系列濃度的溶液（n=5~7，吸收度A在0.2~0.7間），用濃度C對(duì)峰面積A或峰高h(yuǎn)或被測(cè)物的響應(yīng)值之比進(jìn)行回歸處理，線性方程的相關(guān)系數(shù)r應(yīng)≥0.999，截距應(yīng)趨于零，并提供線性關(guān)系圖；④耐用性：考察測(cè)定條件（供試液穩(wěn)定性、樣品提取次數(shù)、時(shí)間、比色法中顯色劑用量、反應(yīng)溫度、時(shí)間、pH值等）有微小變動(dòng)時(shí)，測(cè)定結(jié)果不受影響的承受程度，如測(cè)試條件要求苛刻時(shí)則應(yīng)在方法中注明；⑤靈敏度：作為常量分析法，此項(xiàng)可不作主要要求。

吸收度A在0.2~0.8間其線形關(guān)系好，利用標(biāo)準(zhǔn)品建立標(biāo)準(zhǔn)曲線后，受測(cè)溶液做適當(dāng)?shù)南♂專蛊湮斩仍?.2~0.8，如果太小或太大，都將影響測(cè)定的準(zhǔn)確性的。

3.請(qǐng)問(wèn)測(cè)化合物純度有哪些方法

化合物純度的鑒定方法

一 通過(guò)TLC的純度的鑒定 1 展開(kāi)溶劑的選擇，不只是至少需要3種不同極性展開(kāi)系統(tǒng)展開(kāi)，通常是首先要選擇三種分子間作用力不同的溶劑系統(tǒng)，如氯仿\甲醇，環(huán)己烷\乙酸乙酯，正丁醇\醋酸\水，分別展開(kāi)來(lái)確定組分是否為單一斑點(diǎn)。這樣做的好處是很明顯的，通過(guò)組份間的各種差別將組分分開(kāi)，有可能幾個(gè)相似組份在一種溶劑系統(tǒng)中是單一斑點(diǎn)，因?yàn)樵撊軇┫到y(tǒng)與這幾個(gè)組分的分子間力作用無(wú)顯著的差別，不足以在TLC區(qū)分。而換了分子間作用力不同的另一溶劑系統(tǒng)，就有可能分開(kāi)。這是用3種不同極性展開(kāi)系統(tǒng)展開(kāi)所不能達(dá)到的。 2 對(duì)于一種溶劑系統(tǒng)，至少需要3種不同極性展開(kāi)系統(tǒng)展開(kāi)，一種極性的展開(kāi)系統(tǒng)將目標(biāo)組分的Rf推至0.5，另兩種極性的展開(kāi)系統(tǒng)將目標(biāo)組分的Rf推至0.8,0.2。其作用是檢查有沒(méi)有極性比目標(biāo)組分更大或更小的雜質(zhì)。 3 顯色方法，光展開(kāi)是不夠的，還要用各種顯色方法。一般一定要使用通用型顯色劑，如10%硫酸，碘，因?yàn)槊糠N顯色劑（不論是通用型顯色劑，還是專屬顯色劑在工作中都遇到他們都有一化合物不顯色的時(shí)候），再根據(jù)組分可能含有混雜組份的情況，選用專屬顯色劑。只有在多個(gè)顯色劑下均為單一斑點(diǎn)，這時(shí)才能下結(jié)論樣品為薄層純 二 通過(guò)熔程，判斷純度。原理很簡(jiǎn)單，純化合物，熔程很短，1~2度?；旌衔锶埸c(diǎn)下降，熔程變長(zhǎng)。 三，基于HPLC的純度鑒定，對(duì)于HPLC因?yàn)槌Ｓ玫南到y(tǒng)較少，加之其分離效果好，我們一般不要求選擇三種分子間作用力不同的溶劑系統(tǒng)，只要求選這三種不同極性的溶劑系統(tǒng)，使目標(biāo)峰在不同的保留時(shí)間出峰。 四，基于軟電離質(zhì)譜的純度鑒定。如ESI-MS,APCI-MS。大極性化合物選用ESI-MS，極性很小的化合物選用APCI-MS，這些軟電離質(zhì)譜的特點(diǎn)是只給出化合物的準(zhǔn)分子離子峰，通過(guò)正負(fù)離子的相互溝通來(lái)確定分子量。如果樣品不純，就會(huì)檢出多對(duì)準(zhǔn)分子離子峰，不但確定了純度，還能明確混雜物的分子量。 五，基于核磁共振的純度鑒定，從氫譜中如果發(fā)現(xiàn)有很多積分不到一的小峰，就有可能是樣品是樣品中的雜質(zhì)。利用門控去偶的技術(shù)通過(guò)對(duì)碳譜的定量也能實(shí)現(xiàn)純度鑒定。 這里只是對(duì)常見(jiàn)的純度鑒定方法做了一個(gè)小結(jié)，從快速，便宜，簡(jiǎn)便的要求出發(fā)，以第一點(diǎn)最合要求，往后次之，所以對(duì)第一點(diǎn)詳加講述。當(dāng)然每種方法多有各自的局限性，如基于氫譜的純度鑒定，如果發(fā)現(xiàn)有很多積分不到一的小峰，還有可能使樣品中的活潑質(zhì)子，基于軟電離質(zhì)譜的純度鑒定，如果混雜物的分子量與目標(biāo)物一樣就無(wú)法 。