研究蛋白質(zhì)功能的方法(研究蛋白質(zhì)之間相互作用的實驗方法)
1.研究蛋白質(zhì)之間相互作用的實驗方法有哪些
白質(zhì)與蛋白質(zhì)之間相互作用構(gòu)成了細胞生化反應(yīng)網(wǎng)絡(luò)的一個主要組成部分，蛋白-蛋白互作網(wǎng)絡(luò)與轉(zhuǎn)錄調(diào)控網(wǎng)絡(luò)對調(diào)控細胞及其信號有重要意義。
把原來spaces空間上的一篇蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)間相互作用研究方法轉(zhuǎn)來，算是實驗技巧分類目錄的首篇。一、酵母雙雜交系統(tǒng) 酵母雙雜交系統(tǒng)是當前廣泛用于蛋白質(zhì)相互作用組學(xué)研究的一種重要方法。
其原理是當靶蛋白和誘餌蛋白特異結(jié)合后，誘餌蛋白結(jié)合于報道基因的啟動子，啟動報道基因在酵母細胞內(nèi)的表達，如果檢測到報道基因的表達產(chǎn)物，則說明兩者之間有相互作用，反之則兩者之間沒有相互作用。將這種技術(shù)微量化、陣列化后則可用于大規(guī)模蛋白質(zhì)之間相互作用的研究。
在實際工作中，人們根據(jù)需要發(fā)展了單雜交系統(tǒng)、三雜交系統(tǒng)和反向雜交系統(tǒng)等。Angermayr等設(shè)計了一個SOS蛋白介導(dǎo)的雙雜交系統(tǒng)。
可以研究膜蛋白的功能，豐富了酵母雙雜交系統(tǒng)的功能。此外，酵母雙雜交系統(tǒng)的作用也已擴展至對蛋白質(zhì)的鑒定。
二、噬茵體展示技術(shù) 在編碼噬菌體外殼蛋白基因上連接一單克隆抗體的DNA序列，當噬菌體生長時，表面就表達出相應(yīng)的單抗，再將噬菌體過柱，柱上若含目的蛋白，就會與相應(yīng)抗體特異性結(jié)合，這被稱為噬菌體展示技術(shù)。此技術(shù)也主要用于研究蛋白質(zhì)之間的相互作用，不僅有高通量及簡便的特點，還具有直接得到基因、高選擇性的篩選復(fù)雜混合物、在篩選過程中通過適當改變條件可以直接評價相互結(jié)合的特異性等優(yōu)點。
目前，用優(yōu)化的噬菌體展示技術(shù)，已經(jīng)展示了人和鼠的兩種特殊細胞系的cDNA文庫，并分離出了人上皮生長因子信號傳導(dǎo)途徑中的信號分子。三、等離子共振技術(shù) 表面等離子共振技術(shù)（Surface Plasmon Resonance,SPR）已成為蛋白質(zhì)相互作用研究中的新手段。
它的原理是利用一種納米級的薄膜吸附上“誘餌蛋白”，當待測蛋白與誘餌蛋白結(jié)合后，薄膜的共振性質(zhì)會發(fā)生改變，通過檢測便可知這兩種蛋白的結(jié)合情況。SPR技術(shù)的優(yōu)點是不需標記物或染料，反應(yīng)過程可實時監(jiān)控。
測定快速且安全，還可用于檢測蛋白一核酸及其它生物大分子之間的相互作用。四、熒光能量轉(zhuǎn)移技術(shù) 熒光共振能量轉(zhuǎn)移（FRET ）廣泛用于研究分子間的距離及其相互作用； 與熒光顯微鏡結(jié)合，可定量獲取有關(guān)生物活體內(nèi)蛋白質(zhì)、脂類、DNA 和RNA 的時空信息。
隨著綠色熒光蛋白（GFP）的發(fā)展，F(xiàn)RET 熒光顯微鏡有可能實時測量活體細胞內(nèi)分子的動態(tài)性質(zhì)。提出了一種定量測量FRET效率以及供體與受體間距離的簡單方法，僅需使用一組濾光片和測量一個比值，利用供體和受體的發(fā)射譜消除光譜間的串擾。
該方法簡單快速，可實時定量測量FRET 的效率和供體與受體間的距離，尤其適用于基于GFP 的供體受體對。五、抗體與蛋白質(zhì)陣列技術(shù) 蛋白芯片技術(shù)的出現(xiàn)給蛋白質(zhì)組學(xué)研究帶來新的思路。
蛋白質(zhì)組學(xué)研究中一個主要的內(nèi)容就是研究在不同生理狀態(tài)下蛋白水平的量變，微型化，集成化，高通量化的抗體芯片就是一個非常好的研究工具，他也是芯片中發(fā)展最快的芯片，而且在技術(shù)上已經(jīng)日益成熟。這些抗體芯片有的已經(jīng)在向臨床應(yīng)用上發(fā)展，比如腫瘤標志物抗體芯片等，還有很多已經(jīng)應(yīng)用再眼就的各個領(lǐng)域里。
六、免疫共沉淀技術(shù) 免疫共沉淀主要是用來研究蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)相互作用[/url]的一種技術(shù)，其基本原理是，在細胞裂解液中加入抗興趣蛋白的抗體，孵育后再加入與抗體特異結(jié)合的結(jié)合于Pansobin珠上的金黃色葡萄球菌蛋白A(SPA)，若細胞中有正與興趣蛋白結(jié)合的目的蛋白，就可以形成這樣一種復(fù)合物：“目的蛋白—興趣蛋白—抗興趣蛋白抗體—SPA\|Pansobin”，因為SPA\|Pansobin比較大，這樣復(fù)合物在離心時就被分離出來。經(jīng)變性聚丙烯酰胺凝膠電泳，復(fù)合物四組分又被分開。
然后經(jīng)Western blotting法，用抗體檢測目的蛋白是什么，是否為預(yù)測蛋白。這種方法得到的目的蛋白是在細胞內(nèi)天然與興趣蛋白結(jié)合的，符合體內(nèi)實際情況，得到的蛋白可信度高。
但這種方法有兩個缺陷：一是兩種蛋白質(zhì)的結(jié)合可能不是直接結(jié)合，而可能有第三者在中間起橋梁作用；二是必須在實驗前預(yù)測目的蛋白是什么，以選擇最后檢測的抗體，所以，若預(yù)測不正確，實驗就得不到結(jié)果，方法本身具有冒險性。七、pull-down技術(shù) 蛋白質(zhì)相互作用的類型有牢固型相互作用和暫時型相互作用兩種。
牢固型相互作用以多亞基蛋白復(fù)合體常見，最好通過免疫共沉淀（Co-IP） 、Pull-down技術(shù)或Far-western法研究。Pull-down技術(shù)用固相化的、已標記的餌蛋白或標簽蛋白（生物素-、PolyHis-或GST-），從細胞裂解液中釣出與之相互作用的蛋白。
通過Pull-down技術(shù)可以確定已知的蛋白與釣出蛋白或已純化的相關(guān)蛋白間的相互作用關(guān)系，從體外傳路或翻譯體系中檢測出蛋白相互作用關(guān)系。
2.蛋白質(zhì)之間相互作用的研究方法有哪些
研究DNA-蛋白質(zhì)相互作用的實驗方法主要包括：a、凝膠阻滯實驗； b、DNase 1 足跡實驗；c、甲基化干擾實驗； d、體內(nèi)足跡實驗； f、拉下實驗。研究蛋白質(zhì)/ 核酸相互作用近期采用的新技術(shù)有：核酸適體技術(shù)、生物信息學(xué)方法、蛋白質(zhì)芯片技術(shù)以及納米技術(shù)等。
蛋白（綠色熒光蛋白或紅色熒光蛋白）的載體中，共轉(zhuǎn)染到功能細胞中（一般選用 COS7 細胞）表達帶有熒光的融合蛋白.這樣，相互作用的兩種蛋白就被標上不同的熒光，可以在細胞內(nèi)用熒光顯微鏡直接觀測.在進行精確細胞定位或共定位時，必須用共聚焦熒光顯微鏡觀測.因為共聚焦熒光顯微鏡（相當于醫(yī)院給病人診斷的 CT）觀測的是細胞內(nèi)一個切面上的顏色.如果在一個切面上在同一區(qū)域看到兩種顏色，就提示這兩種蛋白在該區(qū)域內(nèi)有相互作用.普通熒光顯微鏡看到的是一個立體圖象，無法確定蛋白質(zhì)共定位現(xiàn)象.在進行定位或共定位同時，也可以對細胞核進行染色.這樣，在細胞中就有三種顏色.細胞核的顯色幫助你確定共定位發(fā)生的位置.上面介紹的活細胞定位，其優(yōu)點是表達的熒光蛋白熒光強，沒有背景，觀測方便.
3.蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)功能研究的最新方法有哪些
蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)研究方法進展
X-射線晶體學(xué)技術(shù)
核磁共振衍射技術(shù)
電子顯微技術(shù)
質(zhì)譜法
熒光共振能量轉(zhuǎn)移技術(shù)（FRET）
同源建模預(yù)測蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)
酵母雙雜交，三雜交
CO-IP
雙向電泳
目前已經(jīng)有許多蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)預(yù)測服務(wù)通過因特網(wǎng)對公眾免費開放。由于結(jié)構(gòu)預(yù)測技術(shù)本身的局限性，每種預(yù)測服務(wù)都各有得失。
三級結(jié)構(gòu)預(yù)測（同源建模）：
? 瑞士生物信息研究所 SWISS-MODEL
? 丹麥技術(shù)大學(xué)生物序列分析中心 CPHmodels
? 比利時拿摩大學(xué) ESyPred3D
? 英國癌癥研究中心 3DJigsaw
二級結(jié)構(gòu)預(yù)測（折疊識別）：
? 美國哥倫比亞大學(xué) PredictProtein
? 英國瓦衛(wèi)克大學(xué) PSIpred
? 印度昌迪加爾的微生物技術(shù)研究所 APSSP
? 歐洲生物信息研究所（EBI）Jpred
? 美國加利福尼亞大學(xué) SSpro
α-螺旋傾向性預(yù)測（從無到有）：
? 歐洲分子生物學(xué)實驗室（EMBL） AGADIR
參考文獻：
[1] Masatsune Kainosho1, Takuya Torizawa1, Yuki Iwashita1, Tsutomu Terauchi1, Akira Mei Ono1 and Peter
Güntert2 Optimal isotope labelling for NMR protein structure determinations Nature 440, 52-57 (2 March 2006) |
doi:10.1038/nature04525
[2] Liu D, Lepore BW, Petsko GA, Thomas PW, Stone EM, Fast W, Ringe D. Three-dimensional structure of the quorum-quenching N-acyl homoserine lactone hydrolase from Bacillus thuringiensis.Proc Natl Acad Sci U S A. 2005 Aug 16; 102(33):11882-7
[3]劉買利 張許葉朝輝 提高生物大分子NMR分辨率和靈敏度的有效方法：TROSY和CRINEPT 波譜學(xué)雜志2004.9 371-381
[4]李慧林，施丹，任罡，等. 生物大分子的電子顯微學(xué)[M ]. 見：葉恒強，王元明編. 電子顯微學(xué)進展. 北京：科學(xué)出版社， 2003.
[5]王大能，陳勇，隋森芳. 電子顯微學(xué)在結(jié)構(gòu)生物學(xué)研究中的新進展. 電子顯微學(xué)報， 2003, 10.
[6]Robinson A New Avenue for Mass Spectrometry 2006 February Vol .3 No 2 Nature publishing
[7]Schleifenbaum, A.; Stier, G.; Gasch, A.; et al. J. Am. Chem. Soc., 2004, 126, 11786.
[8]tockholm, D.; Bartoli, M.; Sillon, G.; et al. J. Mol. Biol., 2005, 346, 215.
4.蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)功能研究的最新方法有哪些
蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)研究方法進展X-射線晶體學(xué)技術(shù)核磁共振衍射技術(shù)電子顯微技術(shù)質(zhì)譜法熒光共振能量轉(zhuǎn)移技術(shù)（FRET）同源建模預(yù)測蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)酵母雙雜交，三雜交CO-IP雙向電泳目前已經(jīng)有許多蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)預(yù)測服務(wù)通過因特網(wǎng)對公眾免費開放。
由于結(jié)構(gòu)預(yù)測技術(shù)本身的局限性，每種預(yù)測服務(wù)都各有得失。三級結(jié)構(gòu)預(yù)測（同源建模）：? 瑞士生物信息研究所 SWISS-MODEL? 丹麥技術(shù)大學(xué)生物序列分析中心 CPHmodels? 比利時拿摩大學(xué) ESyPred3D? 英國癌癥研究中心 3DJigsaw二級結(jié)構(gòu)預(yù)測（折疊識別）：? 美國哥倫比亞大學(xué) PredictProtein? 英國瓦衛(wèi)克大學(xué) PSIpred? 印度昌迪加爾的微生物技術(shù)研究所 APSSP? 歐洲生物信息研究所（EBI）Jpred? 美國加利福尼亞大學(xué) SSproα-螺旋傾向性預(yù)測（從無到有）：? 歐洲分子生物學(xué)實驗室（EMBL） AGADIR參考文獻：[1] Masatsune Kainosho1, Takuya Torizawa1, Yuki Iwashita1, Tsutomu Terauchi1, Akira Mei Ono1 and PeterGüntert2 Optimal isotope labelling for NMR protein structure determinations Nature 440, 52-57 (2 March 2006) |doi:10.1038/nature04525[2] Liu D, Lepore BW, Petsko GA, Thomas PW, Stone EM, Fast W, Ringe D. Three-dimensional structure of the quorum-quenching N-acyl homoserine lactone hydrolase from Bacillus thuringiensis.Proc Natl Acad Sci U S A. 2005 Aug 16; 102(33):11882-7[3]劉買利 張許葉朝輝 提高生物大分子NMR分辨率和靈敏度的有效方法：TROSY和CRINEPT 波譜學(xué)雜志2004.9 371-381[4]李慧林，施丹，任罡，等. 生物大分子的電子顯微學(xué)[M ]. 見：葉恒強，王元明編. 電子顯微學(xué)進展. 北京：科學(xué)出版社， 2003.[5]王大能，陳勇，隋森芳. 電子顯微學(xué)在結(jié)構(gòu)生物學(xué)研究中的新進展. 電子顯微學(xué)報， 2003, 10.[6]Robinson A New Avenue for Mass Spectrometry 2006 February Vol .3 No 2 Nature publishing[7]Schleifenbaum, A.; Stier, G.; Gasch, A.; et al. J. Am. Chem. Soc., 2004, 126, 11786.[8]tockholm, D.; Bartoli, M.; Sillon, G.; et al. J. Mol. Biol., 2005, 346, 215.。
5.研究蛋白質(zhì)的兩種策略方法分別是什么
蛋白質(zhì)組學(xué)一經(jīng)出現(xiàn)，就有兩種研究策略。
一種可稱為“竭澤法”，即采用高通量的蛋白質(zhì)組研究技術(shù)分析生物體內(nèi)盡可能多乃至接近所有的蛋白質(zhì)，這種觀點從大規(guī)模、系統(tǒng)性的角度來看待蛋白質(zhì)組學(xué)，也更符合蛋白質(zhì)組學(xué)的本質(zhì)。但是，由于蛋白質(zhì)表達隨空間和時間不斷變化，要分析生物體內(nèi)所有的蛋白質(zhì)是一個難以實現(xiàn)的目標。
另一種策略可稱為“功能法”，即研究不同時期細胞蛋白質(zhì)組成的變化，如蛋白質(zhì)在不同環(huán)境下的差異表達，以發(fā)現(xiàn)有差異的蛋白質(zhì)種類為主要目標。這種觀點更傾向于把蛋白質(zhì)組學(xué)作為研究生命現(xiàn)象的手段和方法。
6.目前研究蛋白互作都有哪些方法,其具體原理步驟特點分別是什么
1.根據(jù)分子大小不同進行分離純化 蛋白質(zhì)是一種大分子物質(zhì)，并且不同蛋白質(zhì)的分子大小不同，因此可以利用一些較簡單的方法使蛋白 質(zhì)和小分子物質(zhì)分開，并使蛋白質(zhì)混合物也得到分離.根據(jù)蛋白質(zhì)分子大小不同進行分離的方法主要有透析、超濾、離心和凝膠過濾等.透析和超濾是分離蛋白質(zhì)時常用的方法.透析是將待分離的混合物放入半透膜制成的透析袋中，再浸入透析液進行分離.超濾是利用離心力或壓力強行使水和其它小分子通過半透膜，而蛋白質(zhì)被截留在半透膜上的過程.這兩種方法都可以將蛋白質(zhì)大分子與以無機鹽為主的小分子分開.它們經(jīng)常和鹽析、鹽溶方法聯(lián)合使用，在進行鹽析或鹽溶后可以利用這兩種方法除去引入的無機鹽.由于超濾過程中，濾膜表面容易被吸附的蛋白質(zhì)堵塞，以致超濾速度減慢，截流物質(zhì)的分子量也越來越小.所以在使用超濾方法時要選擇合適的濾膜，也可以選擇切向流過濾得到更理想的效果 離心也是經(jīng)常和其它方法聯(lián)合使用的一種分離蛋白質(zhì)的方法.當?shù)鞍踪|(zhì)和雜質(zhì)的溶解度不同時可以利用離心的方法將它們分開.例如，在從大米渣中提取蛋白質(zhì)的實驗中，加入纖維素酶和α-淀粉酶進行預(yù)處理后，再用離心的方法將有用物質(zhì)與分解掉的雜質(zhì)進行初步分離[3].使蛋白質(zhì)在具有密度梯度的介質(zhì)中離心的方法稱為密度梯度（區(qū)帶）離心.常用的密度梯度有蔗糖梯度、聚蔗糖梯度和其它合成材料的密度梯度.可以根據(jù)所需密度和滲透壓的范圍選擇合適的密度梯度.密度梯度離心曾用于純化蘇云金芽孢桿菌伴孢晶體蛋白，得到的產(chǎn)品純度高但產(chǎn)量偏低.蔣辰等[6]通過比較不同密度梯度介質(zhì)的分離效果，利用溴化鈉密度梯度得到了高純度的蘇云金芽孢桿菌伴孢晶體蛋白.凝膠過濾也稱凝膠滲透層析，是根據(jù)蛋白質(zhì)分子大小不同分離蛋白質(zhì)最有效的方法之一.凝膠過濾的原理是當不同蛋白質(zhì)流經(jīng)凝膠層析柱時，比凝膠珠孔徑大的分子不能進入珠內(nèi)網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，而被排阻在凝膠珠之外，隨著溶劑在凝膠珠之間的空隙向下運動并最先流出柱外；反之，比凝膠珠孔徑小的分子后流出柱外.目前常用的凝膠有交聯(lián)葡聚糖凝膠、聚丙烯酰胺凝膠和瓊脂糖凝膠等.在甘露糖蛋白提純的過程中使用凝膠過濾方法可以得到很好的效果，純度鑒定證明產(chǎn)品為分子量約為32 kDa、成分是多糖∶蛋白質(zhì)（88∶12）、多糖為甘露糖的單一均勻糖蛋白[1].凝膠過濾在抗凝血蛋白的提取過程中也被用來除去大多數(shù)雜蛋白及小分子的雜質(zhì)[7]. 2.根據(jù)溶解度不同進行分離純化 影響蛋白質(zhì)溶解度的外部條件有很多，比如溶液的pH值、離子強度、介電常數(shù)和溫度等.但在同一條件下，不同的蛋白質(zhì)因其分子結(jié)構(gòu)的不同而有不同的溶解度，根據(jù)蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)的特點，適當?shù)馗淖兺獠織l件，就可以選擇性地控制蛋白質(zhì)混合物中某一成分的溶解度，達到分離純化蛋白質(zhì)的目的.常用的方法有等電點沉淀和pH值調(diào)節(jié)、蛋白質(zhì)的鹽溶和鹽析、有機溶劑法、雙水相萃取法、反膠團萃取法等. 等電點沉淀和pH值調(diào)節(jié)是最常用的方法.每種蛋白質(zhì)都有自己的等電點，而且在等電點時溶解度最 低；相反，有些蛋白質(zhì)在一定pH值時很容易溶解.因而可以通過調(diào)節(jié)溶液的pH值來分離純化蛋白質(zhì).王洪新等[8]研究茶葉蛋白質(zhì)提取過程發(fā)現(xiàn)，pH值為時茶葉蛋白提取效果最好，提取率達到36·8%，初步純化得率為91·0%.李殿寶[9]在從葵花脫脂粕中提取蛋白質(zhì)時將蛋白溶液的pH值調(diào)到3~4，使目標蛋白于等電點沉淀出來.等電點沉淀法還應(yīng)用于葡萄籽中蛋白質(zhì)的提取.李鳳英等[10]測得葡萄籽蛋白質(zhì)的等電點為3·8.他們利用堿溶法提取葡萄籽蛋白質(zhì)，得到了最佳的提取工藝為：以1*10-5mol·L-1的NaOH溶液，按1∶5的料液比，在40℃攪拌40 min，葡萄籽蛋白質(zhì)提取率達73·78%.另外還可以利用堿法提取大米蛋白，其持水性、吸油性和起泡性等均優(yōu)于酶法提取[11].利用酸法提取得到的鰱魚魚肉蛋白質(zhì)無腥味、色澤潔白，蛋白質(zhì)產(chǎn)率高達90%[12]. 蛋白質(zhì)的鹽溶和鹽析是中性鹽顯著影響球狀蛋白質(zhì)溶解度的現(xiàn)象，其中，增加蛋白質(zhì)溶解度的現(xiàn)象稱鹽溶，反之為鹽析.應(yīng)當指出，同樣濃度的二價離子中性鹽，如MgCl2、（NH4）2SO4對蛋白質(zhì)溶解度影響的效果，要比一價離子中性鹽如NaCl、NH4Cl大得多.在葡萄籽蛋白提取工藝中除了可以利用堿溶法還可以利用鹽溶法來提取蛋白質(zhì)，其最佳提取工藝是：以10%NaCl溶液，按1∶25的料液比，在30℃攪拌提取30min，蛋白質(zhì)提取率為57·25%[10].鹽析是提取血液中免疫球蛋白的常用方法，如多聚磷酸鈉絮凝法、硫酸銨鹽析法，其中硫酸銨鹽析法廣泛應(yīng)用于生產(chǎn).由于硫酸銨在水中呈酸性，為防止其對蛋白質(zhì)的破壞，應(yīng)用氨水調(diào)pH值至中性.為防止不同分子之間產(chǎn)生共沉淀現(xiàn)象，蛋白質(zhì)樣品的含量一般控制在0·2% ~2·0%.利用鹽溶和鹽析對蛋白質(zhì)進行提純后，通常要使用透析或者凝膠過濾的方法除去中性鹽[13]. 有機溶劑提取法的原理是：與水互溶的有機溶劑（如甲醇、乙醇）能使一些蛋白質(zhì)在水中的溶解度顯著降低；而且在一定溫度、pH值和離子強度下，引起蛋白質(zhì)沉淀的有機溶劑的濃度不同，因此，控制有機溶劑的濃度可以分離純化蛋白質(zhì).例如，在冰浴中磁力攪拌下，在4℃預(yù)冷的培養(yǎng)液中緩慢。
